【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學，具體涉及一種耐有機溶劑的高活性rna切割型脫氧核酶(rna-cleaving?dnazyme)的專利技術及其應用。
技術介紹
1、脫氧核酶(dnazyme)是一類人工合成的具有催化功能的核酸分子主要通過體外篩選(in?vitro?selection)或定向進化(directed?evolution)技術從隨機dna文庫中分離獲得。最早的dnazyme是以pb2+離子為輔助因子從隨機dna文庫篩選獲得，在pb2+存在下催化酯交換反應。目前已發現的dnazyme可以催化包括dna或rna的切割、磷酸化或烷基化等多種反應類型。相比于蛋白酶而言，dnazyme具有分子量小，可化學合成且穩定性高，免疫原性低，可在目標物(如金屬離子、小分子或大分子等)刺激下發生催化反應產生信號等優勢，因此在生物傳感、生物治療、邏輯運算以及分子器件等領域有廣闊應用前景。其中，以具有rna切割活性的dnazyme最引人關注，目前基于dnazyme的重金屬離子便攜式探測器已成功商業化。
2、rna切割型dnazyme由底物鏈和酶鏈組成。底物鏈除了為完整的rna序列外，目前還常用單個rna堿基嵌入到dna序列作為底物來篩選dnazyme，其切割位點通常為rna與dna連接的磷酸二酯鍵。酶鏈為dna序列，一般包含催化區域和底物結合臂區域。dnazyme可通過順式或反式兩種模式催化底物切割，前者為dnazyme和底物連接成一個分子，后者為dnazyme和底物分別作為兩個獨立的分子。目前大多數公開報道的dnazyme在正常生理狀態或
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種獲得高活性rna切割型dnazyme的篩選文庫設計策略、耐有機溶劑的高活性的rna切割型dnazyme及其潛在應用，以解決或改善現有技術中的dnazyme活性不高、難以在含有機溶劑條件下應用等問題。
2、為了實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、本專利技術第一方面提供耐有機溶劑的rna切割型dnazyme篩選或設計文庫，所述文庫基于dnazyme?e3p(5’-aagtggtgcccggaaagggtgactc?a-底物識別區-3’)構建，包括：在e3p的3’和5’端分別引入若干個堿基作為pc?r引物識別區、在可變區域引入隨機序列，其中e3p的可變區域是指e3的5’端起第20-26個堿基。
4、在本專利技術的具體實施方式中，所述隨機序列的長度為10-60個堿基，優選20-50個堿基，再優選30-50個堿基，最優選40個堿基。
5、在本專利技術的具體實施方式中，所述引物識別區的長度分別為16-19個堿基。
6、在本專利技術的具體實施方式中，5’端引入atacag，3’端引入gtccga，與e3原有的一部分序列一起作為引物識別區域。
7、在本專利技術的具體實施方式中，5’端pcr引物為：5’-atacagaagtggtg?ccc-3’；3’端pcr引物為：5’tcggacctatgaactgatg-3’。
8、在本專利技術的具體實施方式中，所述引入是指隨機序列插入可變區，或替代可變區的部分或全部堿基。
9、優選地，底物識別區為大于10nt的任意dna序列；優選為5’-tcagttca?tag-3’。
10、在本專利技術的具體實施方式中，所述dnazyme篩選或設計文庫包括如下序列的核酸分子：5’-atacagaagtggtgcccggaaagggtg-n40-actcatcag?ttcataggtccga-3’，其中n40是40個隨機堿基。
11、本專利技術第二方面提供耐有機溶劑的切割rna的dnazyme，所述dnazyme包括如下結構：從5’到3’依次包含6nt的5’部分引物識別區，e3p的1-19位的莖環區，e3p的20-26位的可變區，以及任選位于e3p可變區的定向進化區(通過體外篩選從隨機文庫中獲得的序列)，底物識別區，任選的3’部分引物識別區；
12、其中所述酶的的3’端還可以任選地包含1-6個，優選1-3個堿基的截短，5’端1位和2位的堿基可以包含任意突變，所述位置相對于e3p確定；
13、所述定向進化區為：
14、tj11-3定向進化區：gcgctgtgtaacgtgcatggtgagttacgcgcga?gatagtac(seq?idno.61)；
15、所述e3p的序列為：
16、e3p(5’-aagtggtgcccggaaagg?gtga?ctca-底物識別區-3’)。
17、在本專利技術的具體實施方式中，所述“位于”的含義為插入可變區，或替代可變區的部分或全部堿基。
18、在本專利技術的具體實施方式中，所述定向進化區替代e3p的21-23位(5’→3’)。
19、在本專利技術的具體實施方式中，所述5’引物識別區為atacag。
20、在本專利技術的具體實施方式中，底物識別區為大于10nt的任意dna序列，優選5’-tcagttcatag-3’。
21、在本專利技術的具體實施方式中，所述dnazyme的5’端與底物連接形成順式結構。
22、本專利技術第三方面提供耐有機溶劑的rna切割型dnazyme，包括：
23、1)下述表格中的酶：
24、
25、2)在1)中酶的5’端引入atacag；
26、3)在1)中酶的5’端第1位或第2位，第21、22、23、24或25引入任選的突變，其中所述位置以e3p為參照基準；
27、4)在1)中酶的3’端引入任意長度優選6nt的堿基序列，優選為gtccga；
28、5)在1)中酶的3’端引入不超過6nt的截短，優選不超過3nt的截短，即底物識別區可以小于10nt；
29、6)上述2-5)的酶的5’端與底物連接形成順式結構；
30、7)上述2-6)的任意組合。
31、在本專利技術的具體實施方式中，所述dnazyme為：
32、
33、其中：a突變b(b＝c/g/t)、g突變h(h＝a/t/c)、t突變v(v＝a/g/c)、c突變d(d＝g/a/t)。
34、本專利技術第四方面提供上述dnazyme切割底物反應的用途。
35、在本專利技術的具體實施方式中，所述切割在包含有機溶劑的溶液中進行，優選地，所述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種耐有機溶劑的切割RNA的DNAzyme篩選或設計文庫，所述文庫基于DNAzyme?E3P(5’-AAGTGGTGCCCGGAAAGGGTGACTCA-底物識別區-3’)構建，包括：在E3P的3’和5’端分別引入若干個堿基，與E3P原有的一部分序列一起作為PCR引物識別區、在可變區域引入隨機序列，其中E3P的可變區域是指E3P的5’端起第20-26個堿基；
2.耐有機溶劑的切割RNA的DNAzyme，所述DNAzyme包括如下結構：從5’到3’依次包含5’引物識別區，E3P的1-19位的莖環區，E3P的20-26位的可變區，以及位于E3P可變區任選存在的定向進化區(通過體外篩選從隨機文庫中獲得的序列)，底物識別區，任選的3’引物識別區；
3.耐有機溶劑的RNA切割型DNAzyme，包括：
4.如權利要求3所述的酶，包括：
5.權利要求2-4任一項所述DNAzyme切割底物反應的用途；
6.靶序列核酸激活的多組分DNAzyme(MNAzyme)，所述多組分DNAzyme包含如下部分：
7.權利要求6所述多
8.一種信號放大器，包含權利要求2-4任一項所述的酶和偶聯的生物識別元件例如抗體和適體；
9.一種試劑盒，包含權利要求2-4任一項所述的酶，或權利要求6所述的多組分DNAzyme，或權利要求8所述的信號放大器。
...【技術特征摘要】
1.一種耐有機溶劑的切割rna的dnazyme篩選或設計文庫，所述文庫基于dnazyme?e3p(5’-aagtggtgcccggaaagggtgactca-底物識別區-3’)構建，包括：在e3p的3’和5’端分別引入若干個堿基，與e3p原有的一部分序列一起作為pcr引物識別區、在可變區域引入隨機序列，其中e3p的可變區域是指e3p的5’端起第20-26個堿基；
2.耐有機溶劑的切割rna的dnazyme，所述dnazyme包括如下結構：從5’到3’依次包含5’引物識別區，e3p的1-19位的莖環區，e3p的20-26位的可變區，以及位于e3p可變區任選存在的定向進化區(通過體外篩選從隨機文庫中獲得的序列)，底物識別區，任選的3’引物識別...
【專利技術屬性】
技術研發人員：邴濤，常天俊，李光平，曹倩倩，李素慧，段巧，梁英，張帥奇，孟輝，譚蔚泓，
申請(專利權)人：中國科學院基礎醫學與腫瘤研究所籌，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。