【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學與生物醫學，具體地涉及一種基因工程化的巨噬細胞和制備方法及其應用。
技術介紹
1、多元醇通路(polyol?pathway)是糖代謝的一條重要支路，共包含兩個步驟：首先在糖醇醛縮酶(aldose?reductase,ar)的作用下，利用煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nadph)提供能量，將葡萄糖和半乳糖分別還原為葡萄糖醇或半乳糖醇；之后在葡萄糖醇脫氫酶(sorbitol?dehydrogenase，sodh)的作用下，將葡萄糖醇氧化為果糖，同時生成一分子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)。多元醇通路對于維持糖類與糖醇類在機體內的穩態尤為重要。機體發生炎癥反應的時候，該通路的平衡會被打破(糖類/糖醇類的比例)。例如在l.monocytogenes外傷感染的情況下，成蟲果蠅全身裂解液的糖類水平發生了顯著的降低。hcv病人的血清以及尿液樣本中，同樣呈現出了多元醇通路代謝紊亂的現象。在晚期糖尿病人中，也存在著多元醇通路代謝紊亂的現象，同時糖醇類的堆積伴隨著局部免疫反應的激活。但是，多元醇通路作為糖代謝的支路之一，何時啟動并參與免疫代謝轉換，以及如何參與天然免疫的調控還知之甚少。
2、ar屬于醛酮還原酶超家族(aldo-keto?reductase，akr)，是多元醇通路中的重要限速酶。ar可以還原多種底物，包括醛、醛糖以及糖皮質激素。akr超家族由15個家族組成(akr1-15)，均是各種依賴nadph的氧化還原酶，這些蛋白廣泛涉及羰基解毒、前致癌物激活、脂質代謝、細胞癌變和癌癥治療等。人的ar屬于akr1b
3、在非病理的情況下，ar的表達情況處于靜默或低表達。在受到外界的刺激時，ar的表達量會明顯的上調，這與炎癥的反應過程密切相關。通過ar抑制劑抑制糖醇類的堆積，能夠有效的緩解機體多個部位的炎癥反應。
4、然而，迄今為止尚沒有一個很好的體外免疫細胞模型，可以為研究多元醇通路對炎癥免疫的影響提供一個很好的細胞學研究平臺。
5、因此，本領域亟需提供一種研究多元醇通路對炎癥免疫的影響的體外免疫細胞模型。
技術實現思路
1、本專利技術的旨在提供一種基因工程化的巨噬細胞，所述基因工程化是研究多元醇通路對炎癥免疫的影響的體外免疫細胞模型。
2、在本專利技術的第一方面，提供了一種基因工程化的巨噬細胞，所述基因工程化的巨噬細胞中基因akr1b8被敲除或敲低。
3、在另一優選例中，所述基因工程化的巨噬細胞具有以下一個或多個特征：
4、(1)與未進行akr1b8基因敲除的巨噬細胞相比，所述基因工程化的巨噬細胞觸角比例顯著提高；
5、(2)與未進行akr1b8基因敲除的巨噬細胞相比，所述基因工程化的巨噬細胞多元醇通路的代謝產物山梨糖醇含量顯著下降；和
6、(3)與未進行akr1b8基因敲除的巨噬細胞相比，所述基因工程化的巨噬細胞早期凋亡顯著下降。
7、在另一優選例中，特征(1)中所述的顯著提高是指：所述基因工程化的巨噬細胞的觸角比例/未經基因敲除的巨噬細胞的觸角比例的比值≥3,較佳地≥4。
8、在另一優選例中，特征(2)中所述的顯著提高是指：所述基因工程化的巨噬細胞中多元醇通路的代謝產物山梨糖醇濃度c1/未經基因敲除的巨噬細胞中多元醇通路的代謝產物山梨糖醇濃度c0的比值為0.3-0.6。
9、在另一優選例中，特征(3)中所述的顯著提高是指：所述基因工程化的巨噬細胞的早期凋亡/未經基因敲除的巨噬細胞的早期凋亡的比值為≤2/3，較佳地≤1/2，更佳地≤1/3。
10、在另一優選例中，所述基因工程化的巨噬細胞對過氧化氫所誘導的巨噬細胞早期凋亡具有抵抗性。
11、在另一優選例中，所述的基因工程化的巨噬細胞是敲除或敲低了基因akr1b8的raw264.7細胞。
12、在另一優選例中，所述的敲除是通過用sgrna1和sgrna2進行敲除所獲得的細胞系。
13、在本專利技術的第二方面，提供了一種在體外下調巨噬細胞中多元醇代謝通路的方法，所述方法包括步驟：
14、在體外將巨噬細胞中的基因akr1b8敲除，從而獲得多元醇代謝通路下調的巨噬細胞。
15、在本專利技術的第三方面，提供了一種在體外提高巨噬細胞對過氧化氫所誘導的巨噬細胞早期凋亡抵抗性的方法，所述方法包括：
16、在體外將巨噬細胞中的基因akr1b8敲除，從而獲得基因工程化的巨噬細胞，其中，與未經基因敲除的巨噬細胞相比，所述基因工程化的巨噬細胞對過氧化氫所誘導的巨噬細胞早期凋亡具有提高的抵抗性。
17、在另一優選例中，所述基因工程化的巨噬細胞對過氧化氫所誘導的巨噬細胞早期凋亡的抵抗性與未經基因敲除的巨噬細胞相比較，提高了30％-40％。
18、在本專利技術的第四方面，提供了一種制備如第一方面所述基因工程化的巨噬細胞的方法，所述方法包括步驟：
19、(a)提供待編輯的巨噬細胞；和
20、(b)對所述巨噬細胞進行基因編輯，從而獲得第一方面所述的基因工程化的巨噬細胞。
21、在另一優選例中，所述敲除是指將巨噬細胞中的akr1b8基因轉錄本的第一個外顯子切除，得到akr1b8基因敲除的巨噬細胞。
22、在另一優選例中，還包括對基因工程化的巨噬細胞進行穩定傳代，從而獲得穩定的基因工程化的巨噬細胞系。
23、在本專利技術的第五方面，提供了一種如第一方面所述基因工程化的巨噬細胞的用途，用于：研究多元醇通路對炎癥免疫的影響、多元醇通路對巨噬細胞代謝與功能、研究巨噬細胞多元醇通路影響細菌或病毒感染巨噬細胞的分子機制。
24、在本專利技術的第六方面，提供了一種如第一方面所述基因工程化的巨噬細胞的用途，用于構建體外免疫細胞模型。
25、在本專利技術的第七方面，提供了一種用于制備第一方面所述基因工程化的巨噬細胞的試劑組合，所述試劑組合包括：
26、(a)基因編輯蛋白或其表達載體，所述基因編輯蛋白選自下組：casrx、cpf1、cas9、cas13a、cas13b、cas13c、或其組合；和
27、(b)grna或其表達載體，其中所述grna是引導所述基因編輯蛋白特異性結合akr1b8基因的rna，其中，所述grna的靶向位點序列為sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的靶向核酸序列如seq?id?no:id?no:1所示，所述sgrna2的靶向核酸序列如seq?idno:id?本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬細胞中基因akr1b8被敲除或敲低。
2.如權利要求1所述基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬細胞具有以下一個或多個特征：
3.如權利要求1所述所述的基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬細胞對過氧化氫所誘導的巨噬細胞早期凋亡具有抵抗性。
4.如權利要求1所述所述的基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述的基因工程化的巨噬細胞是敲除或敲低了基因akr1b8的RAW264.7細胞。
5.一種在體外下調巨噬細胞中多元醇代謝通路的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：
6.一種在體外提高巨噬細胞對過氧化氫所誘導的巨噬細胞早期凋亡抵抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：
7.一種制備如權利要求1所述基因工程化的巨噬細胞的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對基因工程化的巨噬細胞進行穩定傳代，從而獲得穩定的基因工程化的巨噬細胞系。
9.一種如權利要求
10.一種如權利要求1所述基因工程化的巨噬細胞的用途，其特征在于，用于構建體外免疫細胞模型。
...【技術特征摘要】
1.一種基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬細胞中基因akr1b8被敲除或敲低。
2.如權利要求1所述基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬細胞具有以下一個或多個特征：
3.如權利要求1所述所述的基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬細胞對過氧化氫所誘導的巨噬細胞早期凋亡具有抵抗性。
4.如權利要求1所述所述的基因工程化的巨噬細胞，其特征在于，所述的基因工程化的巨噬細胞是敲除或敲低了基因akr1b8的raw264.7細胞。
5.一種在體外下調巨噬細胞中多元醇代謝通路的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：
6.一種在體外提高...
【專利技術屬性】
技術研發人員：潘磊，趙婭婭，張苗苗，李華萍，
申請(專利權)人：中國科學院上海巴斯德研究所，
類型：發明
國別省市：
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