【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及用于肝癌診斷的一系列rna與蛋白質組成的生物標志物組合、基于該生物標志物組合構建的logistics模型，及其在肝癌診斷中的應用，屬于腫瘤醫藥領域。
技術介紹
1、由于肝癌發病隱匿，缺乏特征性臨床表現，60-70％的患者確診時已處于中晚期，失去了手術機會，5年生存率僅為12％。相比于中晚期肝癌，早期肝癌患者的5年生存率超過60％，且治療費用僅為晚期肝癌的七分之一，因此，肝癌“早診早治”是提高肝癌臨床療效、降低肝癌患者社會經濟負擔的關鍵。
2、各國肝臟協會及我國原發性肝癌診療指南均指出，高風險人群應當接受每6個月一次的肝癌篩查，然而，只有不到20％的風險人群進行了規律監測。除去患者個人認知因素外，現有檢測手段難以普及以及肝癌檢出率低是肝癌篩查工作的主要挑戰。肝臟超聲與血清甲胎蛋白(afp)檢測是目前肝癌篩查的主要手段。雖然超聲檢查對肝癌診斷的總體敏感性達到了84％，但其檢測早期肝癌的敏感性僅為47％，這很大程度上是由于超聲檢查效果依賴操作者的經驗與技術，以及脂肪肝人群增加所導致的視野不佳，導致風險人群篩查率低下。afp檢測雖然較少受設備條件及主觀因素限制，但afp的功能及與肝癌的相關性尚未被完全闡明，且其診斷早期肝癌敏感性同樣不足60％，即使與超聲聯合用于篩查，敏感性也僅為63％，對于提高早診率的作用仍然有限。雖然許多研究者通過引入afp亞型及維生素k缺乏誘導蛋白pivka-ii等指標建立多指標評分模型(如galad評分)用于篩查，也僅能取得60％左右的診斷敏感性。ct與mr雖然在肝癌診斷上具有較高的準確
3、因此，近年來肝癌篩查領域著重圍繞新型標志物的液體活檢技術，包括dna甲基化標志物、游離dna(cfdna)、循環腫瘤dna(ctdna)和細胞外囊泡等。通過對外周血液中腫瘤細胞釋放的生物組分進行檢測來實現肝癌早篩，在研究隊列中敏感性可達82％。然而，現有相關研究同樣存在許多挑戰。以研究最為集中的ctdna為例，由于早期癌癥中ctdna的含量較低，準確區分真實突變和測序錯誤具有一定困難，且即使存在突變，也有超過一半來源于克隆性造血，增加假陽性可能；而對于突變頻率較低的基因，少量血標本存在較高的漏診風險。引入二代測序技術可能有助于提高診斷準確率，但將會大大增加檢測成本，對該篩查技術的應用提出挑戰。因此，雖然fda已對exact?science、萊盟健康、泛生子等國內外公司給出突破性醫療器械認定，但由于預計臨床實際獲益有限，在肝癌領域，fda尚未批準任何液體活檢技術產品上市，相關產品仍需要在大型前瞻性研究中進行驗證。
4、rna檢測是肝癌早篩的又一新興領域，包括微小rna(mirna)、mrna和長非編碼rna(lncrna)。樊嘉院士團隊已基于7種mirna開發我國首款肝癌體外診斷試劑盒，診斷敏感性達到82％。mirna檢測也已被納入國家醫療服務收費項目，表明rna檢測領域前景廣闊。
5、上述研究成果有助于提高我國肝癌人群早診率及生存率，但通過單種生物標志物開展的肝癌早診的敏感性和特異性往往難以達到平衡。因此有必要提出新的肝癌早診標志物檢測矩陣和模型，以更好地平衡診斷敏感性和特異性，進一步提升肝癌早診效率。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題或首要目的是，應用一系列生物標志物解決肝癌早期診斷中敏感性和特異性平衡的問題。
2、本專利技術的再一個目的是，提供用于上述肝癌早期診斷的產品。
3、為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
4、第一方面，提供一種用于早期診斷肝癌的生物標志物組合，由rna類生物標志物和蛋白質類生物標志物組成；所述的rna類生物標志物包括linc01554、mir-222、snord31、circmiriaf、snhg8和rnu5e-1；所述的蛋白質類生物標志物包括siglec5、cxcl10、afp和pivka-ii。
5、所述的linc01554是指ncbi序列號為202299的長鏈非編碼rna；
6、所述的mir-222是指ncbi序列號為407007的微小rna；
7、所述的snord31是指ncbi序列號為9298的小核仁rna；
8、所述的circmiriaf是指ncbi序列號為5887的環狀rna；
9、所述的snhg8是指ncbi序列號為100093630的長鏈非編碼rna；
10、所述的siglec5是ncbi序列號為aaf87846.1的蛋白質；
11、所述的cxcl10是ncbi序列號為aah10954.1的蛋白質；
12、所述的afp是ncbi序列號為eax05681.1的蛋白質；
13、所述的pivka-ii是ncbi序列號為np_001341646.2的蛋白質。
14、本專利技術將所述的生物標志物組合應用于制備肝癌早期診斷試劑。
15、本專利技術所述的方案中，通過使用針對所述生物標志物組合的檢測試劑檢測來自受試者的樣本中各生物標志物的表達水平，即可準確地對受試者患肝癌的情況進行早期診斷和評估。進一步地，所述的來自受試者的樣本是受試者的外周靜脈血、癌旁組織或腫瘤組織中的任意一種或兩種以上；優選外周靜脈血。
16、本專利技術優選的方案中，所述的肝癌早期診斷試劑是基于rna捕獲探針技術、高通量測序、酶聯免疫吸附測定技術的檢測試劑。
17、第二方面，本專利技術還提供一種試劑盒，內含檢測生物標志物表達水平的試劑，以及選自下組的一種或多種物質：容器、使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、助劑或溶劑；所述的檢測生物標志物表達水平的試劑包括檢測本專利技術第一方面所述生物標志物組合中所有標志物表達水平的試劑。進一步地，所述的試劑包括：rna探針和特異性抗體；所述rna探針由本專利技術第一方面所述生物標志物組合中6種rna類生物標志物的特異性核苷酸序列互補片段組成；所述的特異性抗體由本專利技術第一方面所述生物標志物組合中4種蛋白質類生物標志物的特異性抗體組成。
18、所述的使用說明書記載了如何采用試劑盒進行檢測，和如何利用檢測結果對肝癌發生與進展進行判斷。試劑盒的組分可以水介質的形式或以凍干的形式來包裝。
19、第三方明，本專利技術還提供一種基于本專利技術第一方面所述的生物標志物組合構建的肝癌早期診斷logistic模型，包括：
20、1)獲取待診斷個體樣本的有效數據；所述的有效數據包括本專利技術第一方面所述的生物標志物組合中各生物標志物在所述樣本中的表達水平；
21、2)將1)所得所有表達水平數據代入以下模型計算公式中：
22、risk?value＝2.479×linc01554-0.216×mir222+19.078×snord31-0.097×circmiriaf+1.562×snhg8+0.808×rnu5e1-0.003×siglec5+本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于早期診斷肝癌的生物標志物組合，其特征在于：由RNA類生物標志物和蛋白質類生物標志物組成；所述的RNA類生物標志物包括LINC01554、miR-222、SNORD31、circMIRIAF、SNHG8和RNU5E-1；所述的蛋白質類生物標志物包括SIGLEC5、CXCL10、AFP和PIVKA-II。
2.權利要求1所述的生物標志物組合在制備肝癌早期診斷試劑中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述肝癌早期診斷試劑用于檢測來自受試者的樣本中權利要求1所述生物標志物組合中各物質的表達水平。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述的來自受試者的樣本是受試者的外周靜脈血、癌旁組織或腫瘤組織中的任意一種或兩種以上的組合；優選外周靜脈血。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述的肝癌早期診斷試劑是基于RNA捕獲探針技術、高通量測序、酶聯免疫吸附測定技術的檢測試劑。
6.一種試劑盒，內含檢測生物標志物表達水平的試劑，以及選自下組的一種或多種物質：容器、使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、
7.一種基于權利要求1所述的生物標志物組合構建的肝癌早期診斷Logistic模型，包括：
8.如權利要求7所述的模型，其特征在于：1)所述的樣本是來自待診斷個體的血液、肝臟、肝癌及癌旁組織樣本中的任意一種或兩種以上的組合。
9.如權利要求7所述的模型，其特征在于：3)所述的根據2)的計算結果進行肝癌進展判別分析包括：設定9，優選9.58，為計算結果的量化評價標準或閾值，判斷是否患有肝癌；即，當2)所述Risk?value的計算結果大于9時，優選大于9.58時，提示患肝癌；否則提示未患肝癌。
...【技術特征摘要】
1.一種用于早期診斷肝癌的生物標志物組合，其特征在于：由rna類生物標志物和蛋白質類生物標志物組成；所述的rna類生物標志物包括linc01554、mir-222、snord31、circmiriaf、snhg8和rnu5e-1；所述的蛋白質類生物標志物包括siglec5、cxcl10、afp和pivka-ii。
2.權利要求1所述的生物標志物組合在制備肝癌早期診斷試劑中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述肝癌早期診斷試劑用于檢測來自受試者的樣本中權利要求1所述生物標志物組合中各物質的表達水平。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述的來自受試者的樣本是受試者的外周靜脈血、癌旁組織或腫瘤組織中的任意一種或兩種以上的組合；優選外周靜脈血。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述的肝癌早期診斷試劑是基于rna捕獲探針技術、高通量測序、酶聯免疫吸附測定技術的檢測試劑。
6.一種試劑盒，內含檢測生物標志物表達水平的試劑，以及選自下組...
【專利技術屬性】
技術研發人員：丁元，王偉林，畢艷麗，陳霄，張思同，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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