【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫學生物，具體涉及多巴胺能神經元前體細胞的標志物及其應用。
技術介紹
1、帕金森病(parkinson’s?disease，pd)是一種常見的神經退行性疾病，主要由黑質紋狀體多巴胺能神經元的退行性病變引起。目前尚未發現帕金森病的有效治療方法，治療策略仍側重于通過多巴胺能活性的恢復進行癥狀管理，例如：使用左旋多巴的藥物治療及腦深部電刺激。這些治療方法的治療效果都極其有限，無法阻止疾病的發展。細胞移植和替代被認為是最具希望和潛力的pd新療法，可能實現治愈帕金森病。1987年，瑞典隆德大學首次使用胎兒的多巴胺能神經元進行細胞移植。然而，除了胎兒細胞移植中的倫理問題之外，供體細胞的來源以及免疫排斥問題都阻礙著這項治療的發展。近年來，隨著以多能干細胞為代表的生物技術的發展，人多能干細胞(hpscs)包括人胚胎干細胞(hescs)和人誘導多能干細胞(ipscs)能夠被誘導體外分化得到具有功能性的多巴胺能神經元。其誘導分化過程包括底板誘導分化生成增殖前體細胞(包括底板前體細胞，floor?plate?progenitors)，然后經神經源性轉化分化為有絲分裂停止后的多巴胺能神經元前體細胞(postmitoticdopaminergic?neuron?progenitors)，進而分化為成熟的多巴胺能神經元(kriks?et?al.(2011)nature480,547-551；kikuchi?et?al.(2017)nature?548,592-596)。在pd細胞治療中，通常是移植主要包含多巴胺能神經元增殖前體細胞和/或分裂停
2、通過對多能干細胞體外誘導分化及多巴胺能神經元發育過程的解析，目前已經發現報道了一些在多巴胺能神經元增殖前體細胞中選擇性表達的基因，例如lrp4/corin(wo2004/065599，wo?2006/009241)、nato3(wo?2007/021003)、msx1/2(wo?2007/021004)。考慮到增殖前體細胞存在腫瘤發生的風險，另外多巴胺能神經元增殖前體細胞具有多種命運分化潛能，分化的終末細胞除了多巴胺能神經元還包括其它類型神經元及膠質細胞和室管膜細胞等多種細胞類型(jerber?et?al.(2021)nat?genet.53，304～312)。而有絲分裂期后的多巴胺能神經元前體細胞能夠更好得定向分化為多巴胺能神經元，因此細胞治療中使用有絲分裂期后的多巴胺能神經元前體細胞優于使用增殖前體細胞。一些多巴胺能神經元前體細胞的標記物，例如lmx1a(wo?2005/052190)以及包括clstn2和ptpro的多種標志物(wo2022/222974)也被報道。然而這些基因在特異性上有所欠缺，在多巴胺能神經元增殖前體細胞和有絲分裂后的多巴胺能神經元前體細胞均有表達，利用這些標記分子不能有效富集有絲分裂后的多巴胺能神經元前體細胞。因此，尋找、鑒定特異性的多巴胺能神經元前體細胞表面標志物，優化分離純化多巴胺能神經元前體細胞的技術，提供pd細胞療法的產品具有重要的意義。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術要解決的技術問題在于提供多巴胺能神經元前體細胞的表面標志物及其應用。
2、本專利技術的第一方面提供了多巴胺能神經元前體細胞的特異性表面標志物，所述表面標志物包括f3或sstr2中的至少一種。
3、本專利技術中，f3(凝血因子iii)又被稱為組織因子、cd142，屬于組織因子家族的單通道i型膜蛋白。人f3由295個氨基酸組成，其大小約為47kda，包含了一個跨膜區域(252～274號殘基)。
4、本專利技術中，sstr2是生長抑素受體(somatostatin?receptor，sstr)家族的成員，屬于g蛋白偶聯受體，其天然配體是生長抑素(sst)。人sstr2由369個氨基酸組成，包含7個跨膜結構域。
5、本專利技術所述的表面標志物為采用兩種常規人多能干細胞向多巴胺能神經元定向分化的方法誘導分化后，通過對分化過程多個時間點的分化產物單細胞測序分析獲得，具有顯著的細胞特異性。第一種分化方法為lorenz?studer團隊在2011年開發的利用底板誘導從多能干細胞體外定向分化為多巴胺能神經元的方法，(kriks?et?al.(2011)nature480，547～551)，目前其他誘導分化方法是在此方法基礎上的調整。第二種分化方法為lorenz?studer團隊在2021年報道的對第一種方法的優化，分化過程中采用“chir-boost”對wnt信號通路進行雙相激活(kim?et?al.(2021)cell?stem?cell?28，343～355)。本申請的專利技術人發現f3基因在第一種分化方法獲得的有絲分裂期后的多巴胺能神經元前體細胞中特異性表達，該多巴胺能神經元前體細胞群還特異性表達ascl1、th、和tph1這些基因，可以定向分化為多巴胺能神經元。sstr2基因在第二種分化方法獲得的有絲分裂期后的多巴胺能神經元前體細胞中特異性表達，該多巴胺能神經元前體細胞群還特異性表達成神經細胞(neuroblasts)的特征基因neurod1/4、nhlh1/2、和neurog1/2(la?manno?et?al.(2016)cell167，566～580；jerber?et?al.(2021)nat?genet.53，304～312)，也能夠定向分化為多巴胺能神經元，因此本專利技術將f3和/或sstr2陽性的多巴胺能神經元前體細胞命名為定向多巴胺能神經元前體細胞。f3和sstr2表面標志物可以用于分離、純化或者檢測、鑒定具有定向分化能力的多巴胺能神經元前體細胞。
6、本專利技術所述的多巴胺能神經元前體細胞表面標志物f3，其為一種多巴胺能神經元前體細胞特異性表面受體，用于純化多巴胺能神經元前體細胞。在本專利技術的一些具體實施例中，通過使用該特異性表面受體分選多巴胺能神經元前體細胞，能夠有效富集巴胺能神經元前體細胞；并且，利用該多巴胺能神經元前體細胞能夠高效的分化為多巴胺能神經元，分化效率可達30％以上，作為優選的分化率可達40％以上，更優選的50％以上，更優選的60％以上，更優選的70％以上，更優選的80％以上；本專利技術的一些具體實施例中，分化效率高達69％。
7、本專利技術所述的多巴胺能神經元前體細胞的標志物sstr2，其為一種多巴胺能神經元前體細胞特異性表面受體，用于純化多巴胺能神經元前體細胞。在本專利技術的一些具體實施例中，通過使用該特異性表面受體分選多巴胺能神經元前體細胞，能夠有效富集巴胺能神經元前體細胞；并且，利用該多本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.多巴胺能神經元前體細胞的表面標志物，其特征在于，所述表面標志物包括F3或SSTR2中的至少一種。
2.權利要求1所述的表面標志物在鑒別、分離和/或富集多巴胺能神經元前體細胞中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述鑒別包括：
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述候選細胞為神經元前體細胞。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述誘導人多能干細胞分化包括以下步驟：
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，
8.根據權利要求3～7任一項所述的應用，其特征在于，所述判斷包括使用靶向F3和/或SSTR2的試劑與所述候選細胞接觸后，檢測所述候選細胞的F3和/或SSTR2的表達和/或活性水平。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述靶向F3和/或SSTR2的試劑包括靶向編碼F3和/或SSTR2的核酸分子的試劑，和/或靶向F3和/或SSTR22蛋白的試劑。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于
11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于，
12.鑒別、分離或富集多巴胺能神經元前體細胞的試劑，其特征在于，以向權利要求1所述的表面標志物為靶標。
13.鑒別、分離或富集多巴胺能神經元前體細胞的試劑盒，其特征在于，包括輔料和權利要求12所述的試劑。
14.分離和/或富集多巴胺能神經元前體細胞的方法，其特征在于，利用權利要求12所述的試劑和/或權利要求13所述的試劑盒對多巴胺能神經元前體細胞進行分離和/或富集。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于，所述分離和富集的方法包括：熒光標記細胞分選法、免疫磁珠分離法或免疫吸附柱分離法中的任意一種。
16.多巴胺能神經元前體細胞，其特征在于，其由權利要求14或15所述的方法獲得。
17.權利要求16所述的多巴胺能神經元前體細胞經培養分化獲得的多巴胺能神經元細胞。
18.如下i)～ii)所示中的至少一種在神經退行性疾病致病機制通路研究及制備預防、治療神經退行性疾病藥物中的應用：
19.根據權利要求18所述的應用，其特征在于，所述神經退行性疾病包括腦缺血、腦損傷、帕金森癥、腦萎縮、老年癡呆癥、或肌肉萎縮側索硬化中的至少一種。
...【技術特征摘要】
1.多巴胺能神經元前體細胞的表面標志物，其特征在于，所述表面標志物包括f3或sstr2中的至少一種。
2.權利要求1所述的表面標志物在鑒別、分離和/或富集多巴胺能神經元前體細胞中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述鑒別包括：
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述候選細胞為神經元前體細胞。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述誘導人多能干細胞分化包括以下步驟：
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，
8.根據權利要求3～7任一項所述的應用，其特征在于，所述判斷包括使用靶向f3和/或sstr2的試劑與所述候選細胞接觸后，檢測所述候選細胞的f3和/或sstr2的表達和/或活性水平。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述靶向f3和/或sstr2的試劑包括靶向編碼f3和/或sstr2的核酸分子的試劑，和/或靶向f3和/或sstr22蛋白的試劑。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，
11.根據權利要求10所述的應用，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：米格爾·埃斯特班，王東業，佐靜，安艷茹，商周春，
申請(專利權)人：深圳華大生命科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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