【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種量子點單顆粒成像分析技術的建立與應用，屬于化學檢測，具體的涉及一種量子點單顆粒成像分析技術的建立與應用。
技術介紹
1、肝素分子是一種線性黏多糖，其分子高度乙酰化與硫酸化，是自然界存在的電負性最強的物質之一。肝素的戊多糖序列可以與抗凝血酶iii?1:1作用，在治療心血管疾病與血液透析中被被當作抗凝劑廣泛使用[95]。但研究表明，肝素類藥物能夠抑制血小板的數量，長期服用肝素類抗凝血藥物會導致如自發性出血、抑制血小板數量等問題，甚至會導致顱內出血等一系列并發癥的產生。正常情況下，心血管手術時血液肝素含量為2-8u/ml(17-67μm)，手術后和長期護理時血液內肝素含量為0.2-1.2u/ml(1.7-10μm)。因此，現階段在血液中準確定量肝素的濃度及活度，對疾病預防與臨床治療仍具有非常重要的意義。
2、傳統檢測肝素的方法被稱為凝血時間法，包括活化凝血酶時間法(act)和活化部分凝血酶時間法(appt)，但該類方法只能識別肝素卻不能夠準確的定量肝素。近年來建立了一系列準確定量肝素的傳感器方法，如利用肝素恢復已猝滅的熒光體系或誘導熒光體系發生猝滅，或利用肝素誘導熒光物質、金銀納米發生聚集或解離，以此來產生信號增強或減弱。這類方法一般都需要制備信號探針，并且需要復雜的樣品處理來實現血樣中肝素含量的準確測定。
3、基于量子點的單顆粒檢測技術能夠在單分子水平上對樣品進行單個檢測與成像，并具有高選擇性、高靈敏度、高性噪比、低消耗以及快速檢測等優點。在檢測器前(如emccd)加入光柵，利用一級光譜的漂
技術實現思路
1、基于此，本專利技術提供一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素、方法及應用，以解決現有技術中以解決現有肝素檢測方法存在的檢測過程繁瑣，靈敏度低的問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供了一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素、方法及應用，其創新點在于包括以下步驟：
3、步驟s1：qd545標記抗凝血酶iii
4、將體積1.2-1.3μl且濃度為8μmol的qd545由體積8-11μl且濃度為13mg/ml的edc進行活化14-15min后，加入10毫摩爾ph值7.4的478.75μl硼酸緩沖溶液與100iu的9-10μl凝血酶iii形成混合液，將所述混合液在4℃-5℃環境中靜置10-12小時后，用轉速為14000r/min的100kda超濾管超濾5分鐘，最后將混合液用9-10毫升ph值8.3的硼酸緩沖溶液洗滌三次備用；
5、步驟s2：qd655標記魚精蛋白
6、將體積1.2-1.3μl且濃度為8μmol的qd545由體積8-11μl且濃度為13mg/ml的進行活化14-15min后，加入10毫摩爾ph值7.4的478.75μl硼酸緩沖溶液與5-7μl的0.2mg/ml魚精蛋白形成混合液，將所述混合液在23℃-25℃環境中靜置1-2小時后，用轉速為14000r/min的100kda超濾管超濾5分鐘，最后將混合液用10毫升ph值8.3的硼酸緩沖溶液洗滌三次備用；
7、步驟s3：qd545標記抗凝血酶iii、肝素和qd655標記魚精蛋白形成團聚
8、取步驟s1中混合液20納米9-10μl加入濃度為0.5-0.6u/ml肝素鈉標準溶液，加入107.5μl硼酸緩沖液靜置半小時，再加入步驟s2混合液形20納米9-10μl成團聚溶液，其中團聚總體積為200μl，將團聚溶液靜置1小時備用，團聚溶液中形成兩種量子點，分別為qd655量子點和qd545量子點；
9、步驟s4：將步驟3團聚溶液分別在電子耦合器件成像和加入光柵的emccd光譜成像分析量子點二聚體；取步驟s3中團聚溶液量子點成像，以量子點qd655為基準，結合qd545量子點的比例為數據，計算量子點二聚體，再通過量子點團聚體一級條紋判斷量子點二聚體，根據肝素鈉濃度和形成量子點二聚體的比例繪制標準曲線。
10、優選的，所述步驟s1和步驟s2中edc為冷二次水即配即用。
11、優選的，所述步驟s3中取步驟s1中混合液的量為10μl，其中加入肝素鈉標準溶液量濃度為0.5u/ml，也可以加入其他不同濃度的肝素鈉標準溶液，取步驟s2混合液的量為10μl。
12、優選的，所述步驟s1中qd545用量為1.25μl與用量為10μledc進行活化15min，凝血酶iii用量為10μl，ph值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為9-10毫米，其中步驟s1所述混合液在4℃環境中靜置12小時。
13、優選的，所述步驟s2中qd545用量為1.25μl與用量為10μledc進行活化15min，魚精蛋白用量為6μl，ph值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為10毫升，其中步驟s1所述混合液在4℃環境中靜置12小時。
14、優選的，所述步驟s3中加入硼酸緩沖液為10毫米，在反應溫度為25℃時，qd655量子點和qd545量子點混合1小時后，qd655量子點和qd545量子點團聚比例為1:1。
15、優選的，所述步驟s4中量子點成像采用彩色電子耦合器件采集，再利用image?j判斷量子點的團聚情況。
16、優選的，所述ph值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為10毫米。
17、一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素，采用一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法。
18、一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素的應用，應用一種基于高靈敏單顆粒比色檢測肝素應用在肝素檢測中。
19、本專利技術的優點在于：
20、本專利技術通過雙色量子點分別修飾抗凝血酶iii與魚精蛋白，抗凝血酶與肝素的特異性結合，肝素與魚精蛋白的靜電結合，形成三明治夾心結構，在單分子水平上，通過計數方法，靈敏且特異的檢測了肝素。與之前的方法相比，該檢測體系克服了量子點團聚帶來的影響，以atiii特異性識別肝素，雙色夾心結構可以實現共定位與特異性識別，同時利用單分子計數方法，克服了以往使用熒光強度等信號帶來的誤差。因此，該實驗實現了對肝素活性的檢測的同時，降低了肝素的檢測限。對相關的傳感器構建具有一定的示范意義。
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1.一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟S1和步驟S2中EDC為冷二次水即配即用。
3.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟S3中取步驟S1中混合液的量為10μL，其中加入肝素鈉標準溶液量濃度為0.5U/mL，取步驟S2混合液的量為10μL。
4.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟S1中QD545用量為1.25μL與用量為10μLEDC進行活化15min，凝血酶III用量為10μL，pH值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為9-10毫米，其中步驟S1所述混合液在4℃環境中靜置12小時。
5.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟S2中QD545用量為1.25μL與用量為10μLEDC進行活化15min，魚精蛋白用量為6μL，pH值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為10毫升，其中步驟S1所述混合液在4℃環境中靜
6.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟S3中加入硼酸緩沖液為10毫米，在反應溫度為25℃時，QD655量子點和QD545量子點混合1小時后，QD655量子點和QD545量子點團聚比例為1:1。
7.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟S4中量子點成像采用彩色電子耦合器件采集，再利用Image?J判斷量子點的團聚情況。
8.如權利要求4所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述pH值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為10毫米。
9.一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素，采用如權利要求1至8其中任何一項所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素采用高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法制備。
10.一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素的應用，應用如權利要求9所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素，其特征在于：一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素應用在肝素檢測中。
...【技術特征摘要】
1.一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟s1和步驟s2中edc為冷二次水即配即用。
3.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟s3中取步驟s1中混合液的量為10μl，其中加入肝素鈉標準溶液量濃度為0.5u/ml，取步驟s2混合液的量為10μl。
4.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟s1中qd545用量為1.25μl與用量為10μledc進行活化15min，凝血酶iii用量為10μl，ph值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為9-10毫米，其中步驟s1所述混合液在4℃環境中靜置12小時。
5.如權利要求1所述的一種高靈敏單顆粒比色檢測肝素方法，其特征在于：所述步驟s2中qd545用量為1.25μl與用量為10μledc進行活化15min，魚精蛋白用量為6μl，ph值8.3的硼酸緩沖溶液的用量為10毫升，其中...
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