【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法。
技術(shù)介紹
1、骨骼肌由不同類型的肌纖維組成，目前，公認(rèn)的哺乳動(dòng)物骨骼肌肌纖維類型的分類是依據(jù)myhc亞型的不同，將肌纖維分為4種類型，即ⅰ型(慢速氧化型肌纖維)、ⅱa型(快速氧化型肌纖維)、ⅱb型(快速酵解型肌纖維)和ⅱx型(中間型肌纖維)，分別表達(dá)myhc1/slow、myhc2a、myhc2b和myhc2x基因。其中氧化型肌纖維含有更多的肌紅蛋白和線粒體，具有更高的氧化能力，并賦予機(jī)體更強(qiáng)的耐力，而快速糖酵解型肌纖維比例高的人患肥胖和相關(guān)代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高，并且在年老時(shí)肌肉更容易萎縮。在畜牧生產(chǎn)中，肉質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量與肌肉中肌纖維類型的比例有直接關(guān)系，慢速氧化型肌纖維含有較多的肌肉含有一定的肌內(nèi)脂肪，肌肉顏色鮮紅，評(píng)分較高；相反，快速酵解型肌纖維含量高的肌肉，肉色蒼白，屠宰后ph下降快，蛋白質(zhì)降解程度增加，會(huì)導(dǎo)致pse肉的產(chǎn)生。因此，闡明調(diào)控肌纖維類型形成的分子機(jī)制對(duì)于肌肉相關(guān)疾病的治療和肉質(zhì)性狀的改善尤為重要。
2、近年來(lái)，在肌纖維形成和轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控機(jī)制研究中鑒定出了許多天然化合物能夠調(diào)控肌纖維類型形成或轉(zhuǎn)化從而影響肉性狀和肌肉功能。例如用小分子琥珀酸(succinate)處理小鼠后快速酵解型肌纖維向慢速氧化型肌纖維轉(zhuǎn)變，小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力增強(qiáng)；槲皮素處理小鼠后氧化型肌纖維相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，并且肌肉功能增加。煙酸補(bǔ)充劑喂養(yǎng)綿羊，氧化型肌纖維比例顯著增加，并改善綿陽(yáng)肉質(zhì)性狀，通過(guò)尋找調(diào)節(jié)肌纖維類型和轉(zhuǎn)化的天然小分子藥物，在日常飲食中補(bǔ)充這
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)加深丹參素鈉對(duì)肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為畜牧生產(chǎn)提高肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)及醫(yī)學(xué)上治療肌肉相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其方法包括以下步驟：
3、s1、小分子藥物；
4、s2、c2c12細(xì)胞培養(yǎng)和處理
5、c2c12成肌細(xì)胞(atcc)在37℃和5％co2的高葡萄糖dmem培養(yǎng)基中在10％胎牛血清(fbs)中培養(yǎng)，將細(xì)胞接種在含有10％fbs的dmem中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，通過(guò)添加2％的馬血清誘導(dǎo)其分化4天；
6、s3、小鼠處理
7、從南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心共獲得30只4周齡雄性c57bl/6j小鼠，每籠飼養(yǎng)三到四只小鼠，光照/黑暗周期為12小時(shí)，溫度為23±2℃，自由攝取水和含有10％千卡脂肪的食物，適應(yīng)7天后，將小鼠隨機(jī)分為三組，每組10個(gè)重復(fù)，小鼠口服0mg/kg、5mg/kg和10mg/kg丹參素鈉8周，將丹參素鈉溶解在生理鹽水中，生理鹽水用作對(duì)照，通過(guò)頸椎脫位對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，分別收集小鼠的脛骨前肌(ta)、腓腸肌(gas)和股四頭肌(qua)肌肉并稱重，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為體重(mg/g)；
8、s4、握力和運(yùn)動(dòng)耐力的測(cè)量
9、小鼠口服0mg/kg、5mg/kg和10mg/kg丹參素鈉8周，使用網(wǎng)格強(qiáng)度計(jì)測(cè)試鼠的抓力強(qiáng)度，將鼠輕輕放置在抓握測(cè)試網(wǎng)絡(luò)上，抓握測(cè)試儀的杠桿和小鼠身體呈垂直方向，在將測(cè)試值設(shè)置為零后，快速拉回小鼠并記錄鼠的最大握力，試驗(yàn)進(jìn)行了五次，并確定了最大強(qiáng)度，跑步機(jī)運(yùn)行試驗(yàn)在xp-pt-10b動(dòng)物跑步機(jī)上進(jìn)行；
10、s5、耗氧量的評(píng)估
11、小鼠口服0mg/kg、5mg/kg和10mg/kg丹參素鈉8周，使用tse實(shí)驗(yàn)室主系統(tǒng)檢測(cè)o2消耗量，在測(cè)量之前，讓小鼠適應(yīng)24小時(shí)，測(cè)定24小時(shí)內(nèi)消耗的氧氣量；
12、s6、rna提取和實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)
13、使用trizol試劑從細(xì)胞或肌肉組織中分離總rna，在nanodrop?2000上測(cè)量rna濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna的完整性后，primescript?rt試劑逆轉(zhuǎn)錄總rna(1μg)；
14、s7、westernblot
15、根據(jù)制造商的說(shuō)明，細(xì)胞和組織在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的ripa緩沖液中裂解，蛋白質(zhì)裂解物在5×十二烷基硫酸鈉(sds)樣品緩沖液中在95°c下加熱5分鐘，并通過(guò)10％sds-page(每條泳道30μg)分離，然后，使用mini?trans?blot?cell系統(tǒng)將凝膠轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，用5％脫脂乳封閉膜1.5小時(shí)，將一抗在4℃下孵育過(guò)夜，第二天洗滌膜后在室溫下二抗孵育1小時(shí)，通過(guò)ecl對(duì)膜進(jìn)行可視化，一抗myhc1、myhc2a、myhc2b、myhc?2x、pkm1和β-肌動(dòng)蛋白，其次是igg-hrp結(jié)合抗體，通過(guò)ecl觀察膜上的條帶；
16、s8、免疫熒光染色
17、免疫熒光染色中使用的第一抗體是myhc2a、myhc2b和myhc1，第二抗體是抗小鼠fitc、抗兔fitc，在第二抗體步驟后，在黑暗中孵育期間用dapi對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡捕獲圖像。
18、優(yōu)選的，所述步驟s2中，丹參素鈉溶解在pbs中，用20μm丹參素鈉處理細(xì)胞，pbs用作對(duì)照。
19、優(yōu)選的，所述步驟s3中，所有動(dòng)物試驗(yàn)均按照周口師范學(xué)院動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行(許可證號(hào)zknu-2024009，許可證日期2022年3月5日)。
20、優(yōu)選的，所述步驟s4中，將清醒的小鼠放置在初始速度為10m/min的跑步機(jī)上3分鐘，之后將速度增加到30m/min以引起疲勞，當(dāng)小鼠不能再呆在跑步機(jī)上時(shí)，記錄到這一點(diǎn)的總跑步距離。
21、優(yōu)選的，所述步驟s5中，對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，小鼠在25℃下以12小時(shí)的光照/12小時(shí)的黑暗周期飼養(yǎng)，自由獲取食物和水。
22、優(yōu)選的，所述步驟s6中，采用lightcycler?96系統(tǒng)進(jìn)行qpcr，使用ct(2-δδct)方法分析相對(duì)基因表達(dá)。
23、優(yōu)選的，所述步驟s8中，myhc2a、myhc2b和myhc1的蛋白表達(dá)水平由myhc亞型陽(yáng)性肌管內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)與核總數(shù)的比值決定。
24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果是：
25、1、以小鼠成肌細(xì)胞c2c12和c57bl小鼠為模型，分別在細(xì)胞和個(gè)體水平探究丹參素鈉調(diào)控肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，丹參素鈉灌胃雄性小鼠，進(jìn)行握力、跑步、westernblot、qpcr和免疫熒光染色的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)丹參素鈉處理的小鼠，其肌肉質(zhì)量、慢速氧化型肌纖維的百分比、肌肉耐力、耗氧量與myhc1和myhc2a基因表達(dá)增加，而myhc2b基因的表達(dá)和糖酵解肌纖維的百分比降低；
26、2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：其方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟S2中，丹參素鈉溶解在PBS中，用20μM丹參素鈉處理細(xì)胞，PBS用作對(duì)照。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟S3中，所有動(dòng)物試驗(yàn)均按照周口師范學(xué)院動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行(許可證號(hào)ZKNU-2024009，許可證日期2022年3月5日)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟S4中，將清醒的小鼠放置在初始速度為10m/min的跑步機(jī)上3分鐘，之后將速度增加到30m/min以引起疲勞，當(dāng)小鼠不能再呆在跑步機(jī)上時(shí)，記錄到這一點(diǎn)的總跑步距離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟S5中，對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，小鼠在25℃下以12小時(shí)的光照/12小時(shí)的黑暗周期飼養(yǎng)，自由獲取食物和水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟S8中，MyHC2a、MyHC2b和MyHC1的蛋白表達(dá)水平由MyHC亞型陽(yáng)性肌管內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)與核總數(shù)的比值決定。
...【技術(shù)特征摘要】
1.丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：其方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟s2中，丹參素鈉溶解在pbs中，用20μm丹參素鈉處理細(xì)胞，pbs用作對(duì)照。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟s3中，所有動(dòng)物試驗(yàn)均按照周口師范學(xué)院動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行(許可證號(hào)zknu-2024009，許可證日期2022年3月5日)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參素鈉對(duì)骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述步驟s4中，將清醒的小鼠放置在初始速度為10m/min的跑步機(jī)上3分鐘，之后將速度增加到30m/m...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張?jiān)葡?/a>，吳長(zhǎng)景，吳曉曉，李若琪，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：周口師范學(xué)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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