【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術總體上涉及用于生產衍生自絲狀噬菌體ff(f1、m13或fd)的生物可縮放官能化就緒納米棒(bsfnano)的系統。該系統允許非感染性、熱穩定的同構蛋白納米棒的有效生物生產，納米棒包括允許以正交方式位點特異性重組、化學和酶促附接肽和非肽官能團的修飾。
技術介紹
1、許多醫學和納米技術應用需要使用可被肽(蛋白)或非蛋白官能團正交官能化的顆粒(sarikaya等人，2003)。雖然非生物納米顆粒已經用于一系列診斷和納米技術應用，但是它們產生了幾個問題，例如顆粒本身的毒性和由于在顆粒生產中使用有毒化學品而引起的可持續性問題(wang和tang，2020)。毒性妨礙了需要直接引入患者的醫學治療應用。此外，生產同構的和可正交修改的非生物納米棒是非常困難的(corrigan等人，2021)。
2、迄今為止，在納米技術和生物醫學應用中已經使用了有限數量的生物納米顆粒(包括納米棒)。這些生物納米顆粒中最突出的是絲狀噬菌體ff，大腸桿菌k12的細菌病毒。噬菌體是噬菌體顯示技術的核心，并且已經用作適合于附接官能團的生物顆粒。使用完整噬菌體或含有完整質粒(稱為噬菌粒)的長噬菌體來源的絲狀體的許多醫學和納米技術應用是已知的(barbas?iii等人，2001)。
3、ff絲狀噬菌體(包括f1、fd和m13種)在它們的基因間(ig)序列中攜帶復制和包裝所需的dna序列(model和russel，1988；rakonjac等人，2017)。使用滾環模式一次一條鏈復制噬菌體。ff噬菌體的基因組是單鏈環狀的(陽性；+)單鏈ssd
4、ssdna基因組中的長發夾結構用作絲狀病毒體組裝所需的包裝信號。在感染周期的早期，ssdna從(-)ori復制以增加rf拷貝數(每個細胞高達50個拷貝)。這與感染后期相反，在感染后期ssdna被蛋白pv包被，形成組裝病毒體所需的“包裝底物”。包裝底物中的ssdna形成沃森-克里克樣螺旋，每條鏈與pv二聚體的一個亞基相互作用。例外是包裝信號，即未被pv覆蓋的真正dna螺旋。復合物稱為“包裝底物”，靶向組裝病毒體的跨包膜組裝-分泌機制。
5、(+)ori具有復制蛋白pii在(+)鏈中切割的位點，允許從用作引物的3'oh端開始復制。當合成新(+)鏈時，“舊”(+)鏈被置換。一旦(+)鏈復制完成整圈，在與起始點相同的位點通過pii進行切割，并且“舊”ssdna(+)鏈和新鏈都被密封。“舊”鏈或者用作(-)鏈復制的模板，以允許產生更多的dsdna，dsdna又成為新一輪(+)鏈復制的模板，或者被pv包被以形成用于組裝后代病毒體的包裝底物。
6、ff的噬菌粒顆粒與ff噬菌體相似，但是它們的基因組對應于質粒(稱為噬菌粒)，質粒包括質粒復制起點，作為可選擇標記的抗生素抗性基因，ff復制起點和通常編碼病毒體外殼蛋白的ff基因中的一個(barbas等人，1991)。在醫學和診斷應用中使用ff絲狀噬菌體和衍生的噬菌粒顆粒產生的問題是這些噬菌體和噬菌體衍生的顆粒通常在大多數條件下僅以長絲形式獲得。特別地，ff噬菌體或噬菌粒顆粒的高長徑比干擾了依賴于擴散的應用，例如側流診斷或分析物檢測裝置。
7、據報道，通過從第一個(+)ori復制(+)鏈ssdna直到第二個(復制)(+)ori，包括在噬菌體群體中以低頻率發生的ig序列的噬菌體基因組的小部分的復制導致產生兩種類型的病毒樣顆粒，短的(短干擾顆粒)和長的(原始噬菌體基因組)(enea等人，1977；ravetch等人，1979)。
8、(+)ori由基本部分(命名為a或i)和非基本部分(命名為b或ii)組成。完整的起點是野生型復制蛋白pii的100％活性所需的，而必要部分相對于完整的起點以1％的效率復制，除非使用對(+)ori?a具有增加的親和力的復制蛋白pii的特定突變體(dotto等人，1984b)。
9、對(+)起點功能作圖的廣泛研究表明，如果至少在突變ori(+)上游的相同質粒中存在完整ori(+)a結構域，則截短的(+)ori?a結構域(在3'端的29個殘基(δ29)已從中缺失)允許被pii(復制蛋白)切割(dotto等人，1982，1984a)。在這種排列中，完整的ori(+)用作(+)鏈復制的起始子，而(+)oriδ29用作終止子。當彼此相鄰放置時，這兩個(+)ori序列允許在起始子和終止子切割位點之間產生短的環狀ssdna，并組裝非常短的ff衍生的納米棒(50nm長)，條件是所有需要的ff蛋白由輔助噬菌體提供。
10、在系統中，短ssdna和全長輔助噬菌體dna都被復制并包裝成兩種類型的顆粒，短(50nm)納米棒和全長(900nm)絲狀病毒(specthrie等人，1992)。通過在輔助噬菌體中在piii，小外殼蛋白和釀膿鏈球菌蛋白血清不透明性因子血清型22(sof22)的高親和力纖連蛋白結合結構域(纖連蛋白結合重復序列；fnb)之間構建蛋白融合體，將產生的短納米棒進一步官能化，以允許fnb在納米棒的表面上顯示。將顯示fnb的純化的50nm顆粒用于側流(浸量尺)測定以檢測纖連蛋白，并且顯示與顯示fnb的相同外殼蛋白組成的900nm長的全長噬菌體顆粒相比，顯示更清晰的信號(sattar等人，2015)。
11、然而，如上概述產生的納米棒難以從也產生的全長輔助噬菌體純化，導致包括可變大小納米棒的納米棒制劑，包括高水平的全長病毒體污染。另外，除去全長輔助噬菌體(大多數產生的顆粒)所需的步驟導致納米棒的低最終產率，增加了生產和純化的顯著成本。此外，在上述系統中，每個細胞產生的環狀ssdna拷貝的總數是有限的，復制效率也是如此。
12、使用ff噬菌體和噬菌粒載體產生用于診斷和/或醫學應用的細絲、棒和/或顆粒的另一個問題涉及用作包括這些表達載體的轉化細胞的可選擇標記的抗生素抗性基因在細絲、棒和/或顆粒中的保留。
13、具體地，模板質粒重組可導致完整模板質粒的復制和包裝。在典型的純化納米棒樣本中，這可導致攜帶抗生素抗性基因(以1/106頻率)的較長顆粒的污染?？紤]到在典型的接種程序中使用的顆粒的數目(例如，每只小鼠1012個)，編碼抗生素抗性的基因序列的這種污染水平是不可耐受的，因為它可能導致每次注射106個含有ampr基因的感染性顆粒。
14、基于對絲狀噬菌體感染過程的了解，包括在ff噬菌體和噬菌粒顆粒中的抗生素抗性基因可以轉移到腸道內或環境中的其它細菌中，傳播抗生素抗性基因(russel等人，1988)。此外，來自噬菌體或噬菌粒絲狀體的dna已經顯示被內化到哺乳動物細胞中，導致由其dna編碼的基因的表達，其包括抗生素抗性(burg等人，2002；larocca和baird，2本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種包括核酸表達構建體的納米棒生產系統(NPS)，所述核酸表達構建體包括
2.根據權利要求1所述的NPS，其中，所述至少一種Ff噬菌體復制蛋白是pII。
3.根據權利要求1或2所述的NPS，其中，所述復制組裝盒還包括位于所述PS和所述(+)ori2之間的(-)ori。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的NPS，其中，所述核酸表達構建體是質粒。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的NPS，其中，所述NPS缺乏編碼一種或多種絲狀噬菌體蛋白的第二核酸構建體。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的NPS，其中，所述核酸表達構建體包括編碼Ff噬菌體pI-pXI蛋白的核酸序列。
7.根據權利要求6所述的NPS，其中，編碼每種Ff噬菌體pI-pXI蛋白的任何或所有的所述核酸序列編碼修飾的Ff噬菌體蛋白。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的NPS，其中，所述核酸構建體包括編碼修飾的Ff噬菌體蛋白的核酸序列，所述修飾的Ff噬菌體蛋白包括允許小分子、合成或生物聚合物與所述蛋白化學或酶促綴合的突變，任選地其中所
9.根據權利要求1至8中任一項所述的NPS，其中，所述核酸構建體包括編碼包括琥珀突變的修飾的Ff噬菌體蛋白pVIII的核酸序列。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的NPS，其中，所述核酸構建體包括與編碼異源多肽的核酸序列融合的編碼pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX中至少一種的核酸序列。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的NPS，其中，所述核酸表達構建體還包括編碼營養缺陷型標記的核酸序列。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的NPS，其中，所述(+)ori1和所述PS之間或所述PS和所述(+)ori2之間的所述核酸序列是編碼至少一種Ff噬菌體蛋白的填充核酸序列。
13.根據權利要求12所述的NPS，其中，所述填充核酸序列編碼pVII、pVIII和/或pIX。
14.根據權利要求12或13所述的NPS，其中，所述填充核酸序列還編碼目的原核或真核蛋白。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的NPS，其中，所述細菌是大腸桿菌。
16.一種分離的宿主細胞，其包括根據權利要求1至15中任一項所述的NPS。
17.一種生產納米棒的方法，其包括培養包括根據權利要求1至15中任一項所述的NPS的分離的宿主細胞，并在最佳生長期向所述宿主細胞提供誘導型啟動子的誘導物，由此在所述細胞中表達Ff噬菌體復制蛋白，產生切除并復制的DNA序列，所述DNA序列形成封裝在所述納米棒內的環狀單鏈DNA。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述最佳生長期由所述宿主細胞的所述光密度(OD600)確定。
19.根據權利要求17或18所述的方法，其中，所述Ff噬菌體復制蛋白是pII。
20.一種長度為60-800nm的納米棒，其包封通過pII切割包括絲狀噬菌體(+)ori1、包裝信號(PS)和(+)ori2以及在(+)ori1和所述PS之間或在所述PS和(+)ori2之間的填充核酸序列的復制組裝盒而切除的環狀單鏈DNA，所述填充核酸序列編碼至少一種Ff噬菌體蛋白。
21.根據權利要求20所述的納米棒，其中，所述復制組裝盒還包括所述PS和(+)ori2之間的(-)ori。
22.根據權利要求20或21所述的納米棒，其中，所述填充核酸序列編碼pVII、pVIII和/或pIX或編碼修飾的pVII、pVIII和/或pIX或其組合。
23.根據權利要求22所述的納米棒，其中，編碼所述pVII、pVIII和/或pIX和/或所述修飾的pVII、pVIII和/或pIX的所述核酸序列與編碼異源多肽的核酸序列融合。
24.根據權利要求20至23中任一項所述的納米棒，其中，所述填充核酸序列還編碼可以或不可以與Ff噬菌體蛋白或修飾的Ff噬菌體蛋白融合的異源多肽。
25.根據權利要求20至24中任一項所述的納米棒，其長度為約95-125nm。
26.一種納米棒群體，其包封通過pII切割包括絲狀噬菌體(+)ori1、包裝信號(PS)和(+)ori2以及在(+)ori1和所述PS之間或在所述PS和(+)ori2之間的填充核酸序列的復制組裝盒而切除的環狀單鏈DNA，所述填充核酸序列編碼至少一種Ff噬菌體蛋白，其中所述群體中至少70％的納米棒的長度為約40nm至約800nm。
27.根據權利要求26所述的納米棒群體，...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種包括核酸表達構建體的納米棒生產系統(nps)，所述核酸表達構建體包括
2.根據權利要求1所述的nps，其中，所述至少一種ff噬菌體復制蛋白是pii。
3.根據權利要求1或2所述的nps，其中，所述復制組裝盒還包括位于所述ps和所述(+)ori2之間的(-)ori。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的nps，其中，所述核酸表達構建體是質粒。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的nps，其中，所述nps缺乏編碼一種或多種絲狀噬菌體蛋白的第二核酸構建體。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的nps，其中，所述核酸表達構建體包括編碼ff噬菌體pi-pxi蛋白的核酸序列。
7.根據權利要求6所述的nps，其中，編碼每種ff噬菌體pi-pxi蛋白的任何或所有的所述核酸序列編碼修飾的ff噬菌體蛋白。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的nps，其中，所述核酸構建體包括編碼修飾的ff噬菌體蛋白的核酸序列，所述修飾的ff噬菌體蛋白包括允許小分子、合成或生物聚合物與所述蛋白化學或酶促綴合的突變，任選地其中所述修飾的ff噬菌體蛋白是piii和/或pviii。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的nps，其中，所述核酸構建體包括編碼包括琥珀突變的修飾的ff噬菌體蛋白pviii的核酸序列。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的nps，其中，所述核酸構建體包括與編碼異源多肽的核酸序列融合的編碼piii、pvi、pvii、pviii和pix中至少一種的核酸序列。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的nps，其中，所述核酸表達構建體還包括編碼營養缺陷型標記的核酸序列。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的nps，其中，所述(+)ori1和所述ps之間或所述ps和所述(+)ori2之間的所述核酸序列是編碼至少一種ff噬菌體蛋白的填充核酸序列。
13.根據權利要求12所述的nps，其中，所述填充核酸序列編碼pvii、pviii和/或pix。
14.根據權利要求12或13所述的nps，其中，所述填充核酸序列還編碼目的原核或真核蛋白。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的nps，其中，所述細菌是大腸桿菌。
16.一種分離的宿主細胞，其包括根據權利要求1至15中任一項所述的nps。
17.一種生產納米棒的方法，其包括培養包括根據權利要求1至15中任一項所述的nps的分離的宿主細胞，并在最佳生長期向所述宿主細胞提供誘導型啟動子的誘導物，由此在所述細胞中表達ff噬菌體復制蛋白，產生切除并復制的dna序列，所述dna序列形成封裝在所述納米棒內的環狀單鏈dna。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述最佳生長期由所述宿主細胞的所述光密度(od600)確定。
19.根據權利要求17或18所述的方法，其中，所述ff噬菌體復制蛋白是pii。
20.一種長度為60-800nm的納米棒，其包封通過pii切割包括絲狀噬菌體(+)ori1、包裝信號(ps)和(+)ori2以及在(+)ori1和所述ps之間或在所述ps和(+)ori2之間的填充核酸序列的復制組裝盒而切除的環狀單鏈dna，所述填充核酸序列編碼至少一種ff噬菌體蛋白。
21.根據權利要求20所述的納米棒，其中，所述復制組裝盒還包括所述ps和(+)ori2之間的(-)ori。
22.根據權利要求20或21所述的納米棒，其中，所述填充核酸序列編碼pvii、pviii和/或pix或編碼修飾的pvii、pviii和/或pix或其組合。
23.根據權利要求22所述的納米棒，其中，編碼所述pvii、pviii和/或pix和/或所述修飾的pvii、pviii和/或pix的所述核酸序列與編碼異源多肽的核酸序列融合。
24.根據權利要求20至23中任一項所述的納米棒，其中，所述填充核酸序列還編碼可以或不可以與ff噬菌體蛋白或修飾的ff噬菌體蛋白融合的異源多肽。
25.根據權利要求20至24中任一項所述的納米棒，其長度為約95-125nm。
26.一種納米棒群體，其包封通過pii切割包括絲狀噬菌體(+)ori1、包裝信號(ps)和(+)ori2以及在(+)ori1和所述ps之間或在所述ps和(+)ori2之間的填充核酸序列的復制組裝盒而切除的環狀單鏈dna，所述填充核酸序列編碼至少一種ff噬菌體蛋白，其中所述群體中至少70％...
【專利技術屬性】
技術研發人員：J·拉科尼亞茨，R·L·克薩達，C·達文波特，V·范洪勒，S·哈努姆，M·岡薩雷斯米羅，周雋，S·比塞特，M·拉吉克，
申請(專利權)人：梅西風投有限公司，
類型：發明
國別省市：
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