【技術實現步驟摘要】
技術介紹
1、基因編輯(包括基因組編輯)是一種類型的基因工程，其中在dna序列中，例如在靶向細胞的基因組中插入、缺失/或取代一個或多個核苷酸/核酸。最近利用rna引導的核酸內切酶(例如cas9)的基因編輯策略能夠實現位點特異性dna修飾；然而，已經發現并非所有rna引導的核酸內切酶向導rna對高效地進行編輯。因此，仍然迫切需要鑒定有效地修飾所關注的基因的有效rna引導的核酸內切酶向導rna對。
技術實現思路
1、本公開至少部分基于用于修飾電壓門控鈉通道基因，例如鈉電壓門控通道α亞基9(scn9a)或鈉電壓門控通道α亞基10(scn10a)的有效基因編輯系統的開發。在一些實施方案中，基因編輯系統依賴于對用于有效修飾電壓門控鈉通道基因而具有低脫靶發生率的有效rna引導的核酸內切酶和向導rna對(例如，本文所公開的那些)的鑒定。
2、因此，在一些方面，本公開涉及用于修飾電壓門控鈉通道基因，例如scn9a或scn10a的基因編輯系統。這種基因編輯系統可以包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含編碼rna引導的dna核酸內切酶的第一核苷酸序列，或rna引導的dna核酸內切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含編碼向導rna(grna)的第二核苷酸序列。
3、在一些實施方案中，基因編輯系統可以修飾scn9a基因并且包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含編碼rna引導的dna核酸內切酶的第一核苷酸序列，或rna引導的dna
4、這種基因編輯系統的rna引導的核酸內切酶可以是釀膿葡萄球菌(staphylococcus?pyogenes)(spcas9)，它可以與包含seq?id?no:1-10中任一者的核苷酸序列的grna配對。或者或另外，這種基因編輯系統的rna引導的核酸內切酶可以是金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus)cas9(sacas9)，它可以與包含seq?id?no:11-20中任一者的核苷酸序列的grna配對。
5、在一些實施方案中，基因編輯系統可以修飾scn10a基因并且包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含編碼rna引導的dna核酸內切酶的第一核苷酸序列，或rna引導的dna核酸內切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含編碼向導rna(grna)的第二核苷酸序列，其中所述grna包含seq?id?no:21-40中任一者的核苷酸序列。這種基因編輯系統的rna引導的核酸內切酶可以是spcas9，它可以與包含seq?id?no:21-30中任一者的核苷酸序列的grna配對。或者或另外，這種基因編輯系統的rna引導的核酸內切酶可以是sacas9，它可以與包含seq?id?no:31-40中任一者的核苷酸序列的grna配對。
6、在一些實施方案中，(a)中編碼rna引導的dna核酸內切酶的第一核苷酸序列還可以包含編碼核定位信號(nls)的核苷酸序列，所述核苷酸序列與rna引導的dna核酸內切酶框內融合。在一些實施方案中，nls是sv40?nls。
7、在一些實施方案中，(b)中的第二核苷酸序列還可以包含支架序列。在一些實例中，支架序列可以由sacas9識別。這種支架序列可以包含核苷酸序列guuuuaguacucuggaaacagaaucuacuaaaacaaggcaaaaugccguguuuaucucgucaacuuguuggcgagauuuu(seq?id?no:41)。在其它實例中，支架序列可以由spcas9識別。應了解，由于編碼grna的第二核苷酸序列可以是dna序列或rna序列，因此這個序列中的任何尿嘧啶(u)都可以被胸腺嘧啶(t)置換。
8、在一些實施方案中，(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分是不同的多核苷酸，其中至少一者可以是載體。載體可以是病毒載體，例如腺相關病毒(aav)載體。在一些實施方案中，(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分是不同的aav載體。
9、在一些實施方案中，單個多核苷酸包含(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分。單個多核苷酸可以是載體，所述載體可以是病毒載體，例如aav載體。在一些實施方案中，aav是aav1。
10、在本公開的范圍內還有核酸和病毒顆粒或病毒顆粒組，它們集合地包含本文所公開的任何基因編輯系統。在一些實施方案中，病毒顆粒或病毒顆粒組是一種或多種aav顆粒。
11、在其它方面，本公開涉及編輯電壓門控鈉通道基因，例如scn9a或scn10a的方法，所述方法包括使細胞與以下接觸：(i)本文所公開的任何基因編輯系統；(ii)包含基因編輯系統的核酸；或(iii)病毒顆粒或病毒顆粒組，它們集合地包含基因編輯系統。
12、在一些實施方案中，接觸步驟通過向有需要的受試者施用(a)的基因編輯系統、(b)的核酸或(c)的一個或多個病毒顆粒來進行。在一些實施方案中，受試者是患有疼痛的人類患者。
13、在一些實施方案中，細胞是自體細胞。或者，細胞可以是異源細胞。在一些實施方案中，細胞是干細胞，例如ipsc細胞或間充質干細胞。在一些實例中，所述方法還可以包括向有需要的受試者(例如，患有疼痛的人類患者)施用具有編輯基因的細胞。
14、在本公開的范圍內還有本文所描述的任何基因編輯系統或其組分用于治療疼痛的用途，以及其用于制造供預期醫學治療用的藥劑的用途。
15、下文描述中闡述了本公開的一個或多個實施方案的細節。本公開的其它特征或優點從若干實施方案的詳細描述以及隨附權利要求書將顯而易見。
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1.一種用于修飾鈉電壓門控通道α亞基10(SCNA10)基因的基因編輯系統，所述基因編輯系統包含：
2.如權利要求1所述的基因編輯系統，其中(b)的所述gRNA還包含支架序列。
3.如權利要求2所述的基因編輯系統，其中所述支架序列包含SEQ?ID?NO:41的核苷酸序列。
4.如權利要求1-3中任一項所述的基因編輯系統，其中SaCas9還包含核定位信號(NLS)。
5.如權利要求4所述的基因編輯系統，其中所述NLS是SV40NLS。
6.如權利要求1-5中任一項所述的基因編輯系統，其中(a)的所述第一多核苷酸部分和(b)的所述第二多核苷酸部分是不同多核苷酸。
7.如權利要求6所述的基因編輯系統，其中所述不同多核苷酸中的至少一者是病毒載體。
8.如權利要求7所述的基因編輯系統，其中所述一種或多種病毒載體是一種或多種腺相關病毒(AAV)載體。
9.如權利要求1-8中任一項所述的基因編輯系統，其中單個多核苷酸包含(a)的所述第一多核苷酸部分和(b)的所述第二多核苷酸部分。
10.
11.如權利要求10所述的基因編輯系統，其中所述病毒載體是腺相關病毒(AAV)載體。
12.一種核酸，所述核酸包含權利要求10所述的單個多核苷酸。
13.一種病毒顆粒或病毒顆粒組，所述病毒顆粒或病毒顆粒組集合地包含權利要求1-10中任一項所述的基因編輯系統。
14.如權利要求13所述的病毒顆粒或病毒顆粒組，所述病毒顆粒或病毒顆粒組是一種或多種腺相關病毒(AAV)顆粒。
15.下述在制備用于在有需要的受試者中編輯鈉電壓門控通道α亞基10(SCN10A)基因的藥物中的用途：
16.如權利要求15所述的用途，其中所述受試者是患有疼痛的人類患者。
17.如權利要求16所述的用途，其中所述藥物接觸所述受試者的外周神經系統的神經元。
18.如權利要求15所述的用途，其中所述藥物包含與(a)的所述基因編輯系統、(b)的所述核酸或(c)的所述病毒顆粒接觸的受試者的細胞。
19.如權利要求18所述的用途，其中所述細胞是自體細胞。
20.如權利要求18所述的用途，其中所述細胞是異源細胞。
21.如權利要求19或權利要求20所述的用途，其中所述細胞是干細胞。
22.如權利要求21所述的用途，其中所述干細胞是iPSC細胞或間充質干細胞。
23.如權利要求18-22中任一項所述的用途，其中所述細胞離體與(a)的所述基因編輯系統、(b)的所述核酸或(c)的所述病毒顆粒接觸，然后施用于所述受試者。
24.如權利要求23所述的用途，其中所述受試者是患有疼痛的人類患者。
...【技術特征摘要】
1.一種用于修飾鈉電壓門控通道α亞基10(scna10)基因的基因編輯系統，所述基因編輯系統包含：
2.如權利要求1所述的基因編輯系統，其中(b)的所述grna還包含支架序列。
3.如權利要求2所述的基因編輯系統，其中所述支架序列包含seq?id?no:41的核苷酸序列。
4.如權利要求1-3中任一項所述的基因編輯系統，其中sacas9還包含核定位信號(nls)。
5.如權利要求4所述的基因編輯系統，其中所述nls是sv40nls。
6.如權利要求1-5中任一項所述的基因編輯系統，其中(a)的所述第一多核苷酸部分和(b)的所述第二多核苷酸部分是不同多核苷酸。
7.如權利要求6所述的基因編輯系統，其中所述不同多核苷酸中的至少一者是病毒載體。
8.如權利要求7所述的基因編輯系統，其中所述一種或多種病毒載體是一種或多種腺相關病毒(aav)載體。
9.如權利要求1-8中任一項所述的基因編輯系統，其中單個多核苷酸包含(a)的所述第一多核苷酸部分和(b)的所述第二多核苷酸部分。
10.如權利要求9所述的基因編輯系統，其中所述單個多核苷酸是病毒載體。
11.如權利要求10所述的基因編輯系統，其中所述病毒載體是腺相關病毒(aav)載體。
12.一種核酸，所述核酸包含權利要求10所述的單個多核苷酸。
【專利技術屬性】
技術研發人員：S·薩伊曼，S·卡哈蘭，A·耶恩，S·埃斯帕諾拉，S·J·斯賓塞，
申請(專利權)人：沃泰克斯藥物股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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