【技術實現步驟摘要】
本申請屬于微生物，具體涉及羅伊氏乳桿菌（lactobacillus?reuteri）及其制劑在預防和/或治療酒精性肝損傷中的應用。
技術介紹
1、長期大量飲酒會對肝臟造成損傷，帶來一系列肝臟疾病，最初表現為酒精性脂肪肝，進一步發展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化等酒精性肝損傷（alcoholic?liverdisease，ald），嚴重的還會發展為肝硬化甚至肝癌。酒精性肝損傷（alcoholic?liverdisease，ald）存在嚴重的腸道菌群紊亂、粘膜屏障破壞，導致“腸肝軸”免疫失衡，加劇肝內炎癥損傷。羅伊氏乳桿菌（lactobacillus?reuteri）是一種存在于人和動物消化道中的益生菌。動物研究表明，羅伊氏乳桿菌可顯著改善酒精性肝損傷腸道黏膜屏障功能，同時糾正“腸肝軸”免疫失衡，抑制肝內炎癥和損傷等。
2、酒精性肝損傷的傳統治療主要有戒酒、藥物治療、營養支持、肝臟移植等手段。戒酒雖然是酒精性肝損傷患者最佳的治療手段，但是仍有一半以上患者可能會繼續飲酒，且酒精使用障礙患者戒酒期間往往會出現失眠、躁動、譫妄等酒精戒斷癥狀。研究表明，幾乎所有的酒精性肝損傷患者都伴隨著不同程度的營養不良，及時營養補充可部分改善患者肝功能指標，但不能改善其生存率以及并發癥的發生率。此外，盡管有一些治療酒精性肝損傷的保肝降酶藥物，如水飛薊素、甘草酸苷類等，但并不能很好地改善酒精性肝損傷尤其是酒精性肝硬化患者腸道微生態紊亂和腸道粘膜屏障的破壞，從而使“腸肝軸”免疫失衡持續存在，腸道來源的感染如自發性腹膜炎發生率居高不下。
4、因此通過聯合發揮益生菌及il22的腸道保護功能，構建出一種可高表達il22的基因工程乳酸菌，優化酒精性肝損傷腸道微生態干預技術，精準調控“腸肝軸”平衡，有效改善和阻斷ald肝內炎癥和纖維化進展，具有十分重要的臨床意義。
技術實現思路
1、為實現上述目的，本研究采用以下技術方案：
2、本申請的第一個方面，提供一種預防和/或治療酒精性肝損傷的基因工程乳酸菌。
3、進一步地，所述基因工程乳酸菌為羅伊氏乳桿菌(lactobacillus?reuteri)dsm17938-il22。
4、進一步地，所述dsm17938-il22于2024年3月在中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏編號為cctcc?no：m2024364。
5、進一步地，所述基因工程乳酸菌通過電轉化含有il22基因序列的重組質粒pset4s-himar1-cat-il22制備形成，所述重組質粒pset4s-himar1-cat-il22以pmg36e為載體，且能夠在乳酸菌表達體系中實現il22的穩定表達，其中il22基因序列參見seq?idno.1。
6、本申請的第二個方面，提供一種制備所述基因工程乳酸菌的方法。
7、進一步地，所述方法包括：
8、1）制備羅伊氏乳桿菌dsm17938的感受態細胞；
9、2）將il22電轉化進1）所得的dsm17938感受態細胞中；
10、3）在培養基中篩選2）中轉化成功的菌株。
11、進一步地，所述步驟2）中，電轉化參數為高壓脈沖2.5kv/cm，電容25uf，電阻200ω，電擊5ms。
12、進一步地，所述步驟3）中的培養基為含有5ug/ml氯霉素的mrs固體培養基。
13、本申請的第三個方面，提供一種活性乳酸菌制劑。
14、進一步地，所述活性乳酸菌制劑包含所述基因工程乳酸菌dsm17938-il22或其發酵液，其中活菌數不少于108cfu/ml。
15、進一步地，所述活性乳酸菌制劑為膠囊、片劑、液體飲料或粉末形式。
16、進一步地，所述活性乳酸菌制劑中還包括功能助劑。
17、優選地，所述功能助劑包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、節旋藻、云芝多糖、水蘇糖、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳鐵蛋白中的任意一種或至少兩種的組合。
18、進一步地，所述活性乳酸菌制劑通過口服直接作用于腸道，用于改善腸道微生態和調節腸肝軸免疫反應。
19、本申請的第四個方面，提供一種制備所述活性乳酸菌制劑的方法。
20、進一步地，所述方法包括：
21、1）在培養基中培養所述基因工程乳酸菌dsm17938-il22；
22、2）挑選1）中培養的表達il22的單克隆。
23、進一步地，在步驟1）中，所述培養基為包含5ug/ml氯霉素和1%木糖的乳酸細菌培養基（mrs）。
24、本申請的第五個方面，提供所述基因工程乳酸菌或所述活性乳酸菌制劑在制備用于預防和/或治療酒精性肝損傷產品中的應用。
25、進一步地，所述應用包括:
26、1）所述產品用于預防和/或治療酒精性肝損傷疾病；
27、2）所述產品用于預防和/或治療酒精引起的腸道炎癥及腸道損傷；
28、3）所述產品用于作為功能性益生菌應用到食品、食品添加劑、保健品、藥品或飼料中。
29、與現有技術比，本申請具有以下技術效果：
30、1、本申請首次構建了一種新的基因工程乳酸菌dsm17938-il22，該乳酸菌通過將il22基因序列整合到羅伊氏乳桿菌dsm17938中而成功制備而成，該乳酸菌能夠在乳酸菌表達體系中實現il22的穩定表達。鑒于il22和益生菌兩者都可以有效改善腸道上皮損傷，減輕肝臟炎癥，而益生菌可進一步誘導il22產生，兩者結合可有效加強抗炎效果。與現有外源性重組il22類產品相比，il22與益生菌的結合克服了外源性重組il22靶向腸道口服易降解、利用率低等缺點，且羅伊氏乳桿菌耐胃酸，顯著改善了酒精性肝損傷腸道屏障功能和微生態紊亂。羅伊氏乳桿菌dsm17938-il22使il22與益生菌制劑兩者得到充分的協同作用，進而探索基因工程乳酸菌對“腸肝軸”免疫調節效果。...
【技術保護點】
1.一種預防和/或治療酒精性肝損傷的基因工程乳酸菌，其特征在于，所述基因工程乳酸菌為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus?reuteri)DSM17938-IL22，所述DSM17938-IL22在中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏編號為CCTCC?NO：M2024364。
2.根據權利要求1所述的基因工程乳酸菌，其特征在于，所述基因工程乳酸菌通過電轉化含有IL22基因序列的重組質粒pSET4s-himar1-cat-IL22制備形成，所述重組質粒pSET4s-himar1-cat-IL22以pMG36e為載體，且能夠在乳酸菌表達體系中實現IL22的胞內表達。
3.一種制備如權利要求1或2中任一項所述的基因工程乳酸菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
4.一種活性乳酸菌制劑，其特征在于，所述活性乳酸菌制劑包含如權利要求1所述的基因工程乳酸菌DSM17938-IL22或其發酵液，其中活菌數不少于108cfu/ml。
5.根據權利要求4所述的活性乳酸菌制劑，其特征在于，所述活性乳酸菌制劑為膠囊、片劑、液體飲料或粉末形式。
<...【技術特征摘要】
1.一種預防和/或治療酒精性肝損傷的基因工程乳酸菌，其特征在于，所述基因工程乳酸菌為羅伊氏乳桿菌(lactobacillus?reuteri)dsm17938-il22，所述dsm17938-il22在中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏編號為cctcc?no：m2024364。
2.根據權利要求1所述的基因工程乳酸菌，其特征在于，所述基因工程乳酸菌通過電轉化含有il22基因序列的重組質粒pset4s-himar1-cat-il22制備形成，所述重組質粒pset4s-himar1-cat-il22以pmg36e為載體，且能夠在乳酸菌表達體系中實現il22的胞內表達。
3.一種制備如權利要求1或2中任一項所述的基因工程乳酸菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
4.一種活性乳酸菌制劑，其特征在于，所述活性乳酸菌制劑包含如權利要求1所述的基因工程乳酸菌dsm...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許爛漫，潘一枝，金浩然，顧穎穎，
申請(專利權)人：寧波大學附屬人民醫院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。