【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)專利屬于生物，具體涉及til細(xì)胞培養(yǎng)基及til細(xì)胞培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
1、til(tumor?infiltrating?lymphocytes，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)是腫瘤間質(zhì)中的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞，包括t細(xì)胞及nk細(xì)胞等。這些淋巴細(xì)胞中有部分是針對(duì)腫瘤特異性突變抗原的t細(xì)胞，是深入到敵軍內(nèi)部打擊能力最強(qiáng)的免疫細(xì)胞，被認(rèn)為是一種機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)。近年來(lái)，tils療法已被證實(shí)能夠用于治療黑色素瘤、宮頸癌、肺癌、肉瘤和卵巢癌，在結(jié)直腸癌，乳腺癌等惡性腫瘤中也顯示出巨大潛力，充分顯示出til作為一種細(xì)胞免疫治療手段在腫瘤治療中的潛力；因此，從腫瘤組織中分離til，并在體外進(jìn)行活化及擴(kuò)增后，可作為一種實(shí)用有效的針對(duì)腫瘤患者的特異性免疫治療手段。
2、til主要通過(guò)組織塊培養(yǎng)、酶消化、機(jī)械解離、細(xì)針抽吸等4種方法獲得。現(xiàn)有til細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要以il-2作為主要刺激因子，另外輔以人ab血清作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑共同培養(yǎng)，但此種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞無(wú)法維持較低的分化水平狀態(tài)，其增殖能力和長(zhǎng)期體內(nèi)持久性偏低，并不能滿足臨床有效治療所需的免疫細(xì)胞數(shù)量。
3、因此，本文提出了一種適用于大量擴(kuò)增有殺傷活性til細(xì)胞的til細(xì)胞培養(yǎng)基及til細(xì)胞培養(yǎng)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種適用于大量擴(kuò)增有殺傷活性til細(xì)胞的til細(xì)胞培養(yǎng)基及til細(xì)胞培養(yǎng)方法。
2、為了達(dá)到上述技術(shù)效果，本專利技術(shù)提供了til細(xì)胞培養(yǎng)基，包括活化培養(yǎng)基、增
3、所述的活化培養(yǎng)基的組分包括t細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、8%-12%血小板裂解物、900-1100u/ml白細(xì)胞介素-2、30-50u/ml慶大霉素；
4、所述的增殖培養(yǎng)基的組分包括t細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、4%-6%血小板裂解物、4800-5200u/ml白細(xì)胞介素-2、30-50u/ml慶大霉素。
5、根據(jù)本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述活化培養(yǎng)基中血小板裂解物的體積百分含量為5%，1000u/ml白細(xì)胞介素-2、40u/ml慶大霉素。
6、根據(jù)本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述增殖培養(yǎng)基中血小板裂解物的體積百分含量為10%，5000u/ml白細(xì)胞介素-2、40u/ml慶大霉素。
7、本專利技術(shù)還提供了til細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括使用本專利技術(shù)所述的til細(xì)胞培養(yǎng)基，所述方法具體包括以下步驟：
8、s1、免疫細(xì)胞分離：通過(guò)酶消化腫瘤組織后用淋巴細(xì)胞分離液獲取免疫細(xì)胞，亦或直接用淋巴細(xì)胞分離液獲取惡性胸腹水中的免疫細(xì)胞；
9、進(jìn)一步地，所述s1中的腫瘤組織中分離免疫細(xì)胞的方法具體包括以下步驟：
10、s111、腫瘤組織用生理鹽水清洗，除去脂肪組織、壞死組織及出血塊，用組織剪剪碎，先加入5倍體積胰蛋白酶/edta消化液再加入90-110u/ml的iv型膠原酶、4-6u/ml的dnase?i、75-85u/ml的慶大霉素，與腫瘤組織混勻后置于37℃搖床中100rpm/min消化3h；
11、s112、按照1:1比例加入等體積生理鹽水稀釋組織消化液，用細(xì)胞篩過(guò)濾溶液，濾液離心，棄上清，沉淀用生理鹽水離心清洗；
12、s113、取離心管加入淋巴細(xì)胞分離液，細(xì)胞沉淀用生理鹽水重懸后緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上層，慢升慢降離心；
13、s114、離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層：第一層為稀釋液層，第二層為環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層，第三層為透明分離液層，第四層為組織雜細(xì)胞層，小心吸取第二層到離心管中，加入生理鹽水離心，棄上清，沉淀即為免疫細(xì)胞。
14、進(jìn)一步地，所述s1中的惡性胸腹水中分離免疫細(xì)胞的方法具體包括以下步驟：
15、s121、惡性胸腹水加入離心管離心，棄上清；
16、s122、取離心管加入淋巴細(xì)胞分離液，細(xì)胞沉淀用生理鹽水重懸后緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上層，慢升慢降離心；
17、s123、離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層：第一層為稀釋液層，第二層為環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層，第三層為透明分離液層，第四層為組織雜細(xì)胞層，小心吸取第二層到離心管中，加入生理鹽水離心，棄上清，沉淀即為免疫細(xì)胞。
18、s2、貼壁去除殘留腫瘤細(xì)胞：先配置活化培養(yǎng)基，接著將免疫細(xì)胞置于活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，使腫瘤細(xì)胞貼壁，取上清液離心得到免疫細(xì)胞，其余棄掉，以此除去殘留腫瘤細(xì)胞；
19、進(jìn)一步地，所述s2中貼壁去除殘留腫瘤細(xì)胞的方法具體包括以下步驟：
20、s201、活化培養(yǎng)基配置：t細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基加入8%-12%的血小板裂解物、900-1100u/ml白細(xì)胞介素-2、30-50u/ml慶大霉素；
21、s202、按2×106個(gè)/ml密度重懸于活化培養(yǎng)基后接種于6孔板中，在37℃，5%co2條件下培養(yǎng)3天，輕晃培養(yǎng)板，吸取未貼壁細(xì)胞懸液支離心管中離心，棄上清。
22、s3、til細(xì)胞激活：細(xì)胞沉淀計(jì)數(shù)后按2×106個(gè)/ml密度重懸于活化培養(yǎng)基中，加入90-110ug/ml的植物凝集素pha-p、900-1100ng/ml的cd3單克隆抗體、900-1100ng/ml的cd28單克隆抗體誘導(dǎo)til細(xì)胞的活化和增殖；在37℃，體積百分含量為5%的co2條件下培養(yǎng)3天；
23、進(jìn)一步地，所述的s3的活化培養(yǎng)基中加入的各物質(zhì)組分為：100ug/ml的植物凝集素pha-p、1000ng/ml的cd3?單克隆抗體、1000ng/ml的cd28單克隆抗體。
24、s4、til細(xì)胞激活后進(jìn)行til細(xì)胞活化培養(yǎng)：培養(yǎng)第3天補(bǔ)充活化培養(yǎng)基，之后每3天一次補(bǔ)充活化培養(yǎng)基，補(bǔ)液后til細(xì)胞培養(yǎng)密度不低于1×106個(gè)/ml；
25、s5、當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始指數(shù)生長(zhǎng)后使用增殖培養(yǎng)基進(jìn)行til細(xì)胞的增殖培養(yǎng)，其方法具體包括以下步驟：
26、s501、增殖培養(yǎng)基配置：t細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基加入4%-6%血小板裂解物、4800-5200u/ml白細(xì)胞介素-2、30-50u/ml慶大霉素；
27、s502、til細(xì)胞開(kāi)始指數(shù)生長(zhǎng)后切換為增殖培養(yǎng)基補(bǔ)液，持續(xù)培養(yǎng)40~50d，當(dāng)細(xì)胞不再呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)時(shí)收獲細(xì)胞；
28、s6、最后進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，其方法具體包括以下步驟：
29、s601、取細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)無(wú)菌、支原體、內(nèi)毒素；
30、s602、取細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)t淋巴細(xì)胞分型cd3、cd4、cd8及占比。
31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果主要在于：
32、本專利技術(shù)聯(lián)合使用cd3、cd28的抗體刺激til細(xì)胞，模擬體內(nèi)til細(xì)胞活化的雙信號(hào)作用，同時(shí)利用pha-p，以其具有促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞有絲分裂和誘導(dǎo)干擾素分泌的活性的特性，在體外刺激小淋細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有免疫活性的淋細(xì)胞，并促進(jìn)其分裂，并通過(guò)pha-p與il-2的協(xié)同作用提升til細(xì)胞的增殖能力；且還采用血小板裂解物來(lái)代替病人血漿，以其作為一種能有效支持til本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，包括活化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基，其特征在于：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述活化培養(yǎng)基中血小板裂解物的體積百分含量為5%，1000U/ml白細(xì)胞介素-2、40U/ml慶大霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述增殖培養(yǎng)基中血小板裂解物的體積百分含量為10%，5000U/ml白細(xì)胞介素-2、40U/ml慶大霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括使用所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述S1中的腫瘤組織中分離免疫細(xì)胞的方法具體包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述S1中的惡性胸腹水中分離免疫細(xì)胞的方法具體包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述S2中貼壁去除殘留腫瘤細(xì)胞的方法具體包括以下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TIL細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征
...【技術(shù)特征摘要】
1.til細(xì)胞培養(yǎng)基，包括活化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基，其特征在于：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的til細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述活化培養(yǎng)基中血小板裂解物的體積百分含量為5%，1000u/ml白細(xì)胞介素-2、40u/ml慶大霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的til細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述增殖培養(yǎng)基中血小板裂解物的體積百分含量為10%，5000u/ml白細(xì)胞介素-2、40u/ml慶大霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的til細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括使用所述的til細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃雁林，顧夢(mèng)琪，陳姜蓉，戴永琴，趙樹(shù)凡，李章倩，張濟(jì)斌，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：云南醫(yī)大精準(zhǔn)生命科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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