【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種基因導入率的預測方法。
技術介紹
1、近年來，正在積極進行嵌合抗原受體(car)-t細胞等基因重組細胞藥物(進行了基因導入的/基因被導入的細胞制劑)的研究和開發。對于car-t細胞等基因重組細胞藥物，通過將整體的細胞數乘以導入基因的比例來定義規定制品的量。因此，對于car-t細胞制品，car導入率是制造工序、運輸和給藥中最重要的指標。然而，一直以來將流式細胞術用于測定針對細胞的基因導入率的測定方法，但存在從測定到分析的時間長(6小時至7小時)、和需要復雜的步驟(細胞的染色步驟為手動操作)的問題。例如，非專利文獻1已經報道了使用流式細胞術實施了car-t細胞的測定。
2、現有技術文獻
3、非專利文獻
4、非專利文獻1：cytometry?part?b:clinical?cytometry,第100卷,第2期,第218-224頁
技術實現思路
1、專利技術所要解決的課題
2、本專利技術的課題是提供一種基因導入率的預測方法，所述方法能夠比以往的方法更簡單和高效地測定細胞的基因導入率。
3、用于解決課題的手段
4、本申請專利技術人為實現上述目的而進行了銳意研究，結果發現，通過測定細胞內的復雜度(例如，通過流式細胞術測定的ssc)并將其用作指標，從而能夠簡單且高效地預測動物細胞的基因導入率。
5、本專利技術是基于該見解進一步反復研究而完成的，提供了以下的動物細胞的基因導入率的預測方法。>
6、[1]一種動物細胞的基因導入率的預測方法，其包括：
7、(1)對進行了基因導入的動物細胞的細胞復雜度進行測定的步驟；以及
8、(2)基于在步驟(1)中測定的值預測基因導入率的步驟。
9、[2]根據[1]所述的方法，其中，細胞復雜度是細胞內的復雜度。
10、[3]根據[1]或[2]所述的方法，其中，在步驟(2)中，將細胞復雜度的分布用于預測細胞群的基因導入率。
11、[4]根據[1]至[3]中任一項所述的方法，其中，在步驟(2)中，將細胞復雜度的分布的參數用于預測細胞群的基因導入率。
12、[5]根據[4]所述的方法，其中，細胞復雜度的分布的參數是選自由以下組成的組的至少一種：平均值、中值、眾數、方差、峰度、偏度、最大值、最小值、四分位數、峰高和半寬度。
13、[6]根據[4]所述的方法，其中，細胞復雜度的分布的參數是選自由以下組成的組的至少一種：平均值、中值、眾數、方差、峰度和偏度。
14、[7]根據[3]所述的方法，其中，在步驟(2)中，通過根據細胞復雜度的分布來求出基因被導入的動物細胞的復雜度的分布，從而預測細胞群的基因導入率。
15、[8]根據[1]至[7]中任一項所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過利用流式細胞儀測定側向散射(ssc)或側向熒光(sfl)進行的。
16、[9]根據[1]至[8]中任一項所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過利用流式細胞儀測定ssc或sfl進行的，并且在步驟(2)中，將ssc或sfl的脈沖高度、寬度和面積用于預測細胞群的基因導入率。
17、[10]根據[1]、[2]、[8]或[9]所述的方法，其中，在步驟(2)中，進一步將細胞大小的值用于預測細胞群的基因導入率。
18、[11]根據[10]所述的方法，其中，作為所述細胞大小的值，使用利用流式細胞儀得到的前向散射(fsc)的測定值。
19、[12]根據[11]所述的方法，其中，在步驟(2)中，將fsc的脈沖高度、寬度和面積用于預測細胞群的基因導入率。
20、[13]根據[1]至[7]中任一項所述的方法，其中，細胞復雜度是細胞表面的復雜度。
21、[14]根據[13]所述的方法，其中，所述細胞表面的復雜度是細胞的圓周長、面積包絡度(solidity)、凹凸度(unevenness)、算術平均粗糙度、最大高度、十點平均粗糙度、凹凸平均間隔、局部峰的平均間隔、負載長度比、分形維數、縱橫比、圓形度、圓度或致密度。
22、[15]根據[1]至[7]中任一項所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過測定細胞內細胞器、細胞表面聚糖、細胞膜、細胞脂質、細胞內代謝物、細胞脂肪滴或細胞表面形狀進行的。
23、[16]根據[1]至[7]中任一項所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過測定來源于細胞的自發熒光進行的。
24、[17]根據[1]至[16]中任一項所述的方法，其中，所述動物細胞是免疫細胞。
25、[18]根據[17]所述的方法，其中，所述免疫細胞是t細胞或nk細胞。
26、[19]根據[1]至[16]中任一項所述的方法，其中，所述動物細胞是上皮細胞。
27、[19a]根據[19]所述的方法，其中，所述動物細胞是肝癌細胞。
28、[19b]根據[1]至[19a]中任一項所述的方法，其中，所述動物細胞是人細胞。
29、[20]根據[1]至[19b]中任一項所述的方法，其中，進行基因導入的核酸是編碼嵌合抗原受體的核酸。
30、[21]根據[1]至[12]和[17]至[20]中任一項所述的方法，其中，基因導入細胞與基因未導入細胞之間的細胞復雜度差異按利用流式細胞儀得到的ssc或sfl的測定值計為5％以上。
31、[22]一種用于進行了基因導入的細胞制劑的制造方法，其包括：
32、(i)測定進行了基因導入的動物細胞的復雜度并基于測定得到的值來測定基因導入率的步驟。
33、專利技術效果
34、根據本專利技術的基因導入率的預測方法，與以往方法相比，可以通過更簡單的操作(例如，所需的操作僅是使用測定裝置的自動測定)測定細胞的基因導入率，而不需要復雜的步驟。此外，根據本專利技術的基因導入率的預測方法，可以高效地(例如，在小于5分鐘的短時間段內)測定細胞的基因導入率。
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1.一種動物細胞的基因導入率的預測方法，其包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中，細胞復雜度是細胞內的復雜度。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，將細胞復雜度的分布用于預測細胞群的基因導入率。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，將細胞復雜度的分布的參數用于預測細胞群的基因導入率。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，細胞復雜度的分布的參數是選自由以下組成的組的至少一種：平均值、中值、眾數、方差、峰度、偏度、最大值、最小值、四分位數、峰高和半寬度。
6.根據權利要求4所述的方法，其中，細胞復雜度的分布的參數是選自由以下組成的組的至少一種：平均值、中值、眾數、方差、峰度和偏度。
7.根據權利要求3所述的方法，其中，在步驟(2)中，通過根據細胞復雜度的分布來求出基因被導入的動物細胞的復雜度的分布，從而預測細胞群的基因導入率。
8.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過利用流式細胞儀測定側向散射(SSC)或側向熒光(SFL)進行的。>
9.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過利用流式細胞儀測定SSC或SFL進行的，并且在步驟(2)中，將SSC或SFL的脈沖高度、寬度和面積用于預測細胞群的基因導入率。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，進一步將細胞大小的值用于預測細胞群的基因導入率。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，作為所述細胞大小的值，使用利用流式細胞儀得到的前向散射(FSC)的測定值。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，在步驟(2)中，將FSC的脈沖高度、寬度和面積用于預測細胞群的基因導入率。
13.根據權利要求1所述的方法，其中，細胞復雜度是細胞表面的復雜度。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，細胞表面的復雜度是細胞的圓周長、面積包絡度、凹凸度、算術平均粗糙度、最大高度、十點平均粗糙度、凹凸平均間隔、局部峰的平均間隔、負載長度比、分形維數、縱橫比、圓形度、圓度或致密度。
15.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過測定細胞內細胞器、細胞表面聚糖、細胞膜、細胞脂質、細胞內代謝物、細胞脂肪滴或細胞表面形狀進行的。
16.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過測定來源于細胞的自發熒光進行的。
17.根據權利要求1所述的方法，其中，所述動物細胞是免疫細胞。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述免疫細胞是T細胞或NK細胞。
19.根據權利要求1所述的方法，其中，所述動物細胞是上皮細胞。
20.根據權利要求1所述的方法，其中，進行基因導入的核酸是編碼嵌合抗原受體的核酸。
21.根據權利要求1所述的方法，其中，基因導入細胞與基因未導入細胞之間的細胞復雜度差異按利用流式細胞儀得到的SSC或SFL的測定值計為5％以上。
22.一種進行了基因導入的細胞制劑的制造方法，其包括：
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種動物細胞的基因導入率的預測方法，其包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中，細胞復雜度是細胞內的復雜度。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，將細胞復雜度的分布用于預測細胞群的基因導入率。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，將細胞復雜度的分布的參數用于預測細胞群的基因導入率。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，細胞復雜度的分布的參數是選自由以下組成的組的至少一種：平均值、中值、眾數、方差、峰度、偏度、最大值、最小值、四分位數、峰高和半寬度。
6.根據權利要求4所述的方法，其中，細胞復雜度的分布的參數是選自由以下組成的組的至少一種：平均值、中值、眾數、方差、峰度和偏度。
7.根據權利要求3所述的方法，其中，在步驟(2)中，通過根據細胞復雜度的分布來求出基因被導入的動物細胞的復雜度的分布，從而預測細胞群的基因導入率。
8.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過利用流式細胞儀測定側向散射(ssc)或側向熒光(sfl)進行的。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中細胞復雜度的測定是通過利用流式細胞儀測定ssc或sfl進行的，并且在步驟(2)中，將ssc或sfl的脈沖高度、寬度和面積用于預測細胞群的基因導入率。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟(2)中，進一步將細胞大小的值用于預測細胞群的基因導入率。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，作為...
【專利技術屬性】
技術研發人員：大垣總一郎，飯田友峰，
申請(專利權)人：武田藥品工業株式會社，
類型：發明
國別省市：
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