【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術，具體涉及非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體及其制備方法與應用。
技術介紹
1、非洲豬瘟（african?swine?fever,?asf）是由非洲豬瘟病毒（african?swinefever?virus,?asfv）感染引起的一種豬的急性、熱性、高度接觸性的烈性傳染病。臨床上主要以高熱、皮膚和內臟器官出血、共濟失調和食欲廢絕為主要特征，死亡率接近100%，臨床表現為發熱、皮膚發紺、淋巴結、腎、胃腸粘膜出血等。
2、非洲豬瘟病毒屬于非洲豬瘟病毒科（asfarviridae），非洲豬瘟病毒屬（asfivirus），是該科的唯一成員。asfv基因組大小170~190?kb，是一種在胞質內復制的有囊膜的大型雙股dna病毒，編碼160~175個基因。該病毒粒子的直徑為175-215?nm，呈20面體對稱。用編碼vp72蛋白的b646l基因分析不同地區asfv分離株，可以將asfv流行株分為22個主要的基因型，其中流行于中國的主要是基因ii型。
3、非洲豬瘟病毒結構蛋白p30由病毒基因cp204l編碼，在病毒進入宿主細胞的過程中發揮重要作用，且在病毒感染早期的含量較為豐富。在機體保護性免疫應答的研究中，p30蛋白對病毒的內化有一定的抑制作用，且在感染期間與中和抗體的誘導相關。因此，p30蛋白是非洲豬瘟抗體檢測的主要抗原區。目前非洲豬瘟病毒的檢測主要以聚合酶鏈式反應（pcr）為主，該方法檢測非洲豬瘟病毒基因組dna，而對于非洲豬瘟病毒抗體的檢測方法較為缺乏。
技術實現
1、基于國內最先暴發的基因ii型高致病性asfv-sy18毒株，本專利技術的目的在于提供一種抗p30的單克隆抗體及非洲豬瘟病毒抗體阻斷elisa方法的建立。
2、一種非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由保藏號為cctcc?no:c2024103的雜交瘤細胞產生。
3、所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區包括vh-fr1、vh-cdr1、vh-fr2、vh-cdr2、vh-fr3、vh-cdr3和vh-fr4，其氨基酸序列如seq?id?no.2-seq?idno.8所示；輕鏈可變區包括vl-fr1、vl-cdr1、vl-fr2、vl-cdr2、vl-fr3、vl-cdr3和vl-fr4，其氨基酸序列如seq?id?no.9-seq?id?no.15所示，其編碼根據權利要求1-3任一項所述的抗非洲豬瘟病毒p30蛋白的單克隆抗體。
4、該單克隆抗體的重鏈為igg1型，輕鏈為κ型。
5、所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，由如下步驟制備獲得：非洲豬瘟病毒p30重組蛋白作為抗原，接種balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經過亞克隆篩選和間接elisa鑒定后獲得雜交瘤細胞，所述單克隆抗體由所述的雜交瘤細胞產生。
6、進一步而言：
7、其中所述雜交瘤細胞株的保藏號為cctcc?no:c2024103。該雜交瘤細胞株p30-6e12，命名為hybridoma?cell?line?p30-6e12，保藏時間為2024.9.30，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國，武漢，武漢大學。
8、所述非洲豬瘟病毒p30重組蛋白，根據抗原性分析結果，選取了抗原性較好的9-189?aa氨基酸片段，其n端至c端序列為seq?id?no.1。
9、p30重組蛋白：
10、mkmevifktdlrsssqvvfhagslynwfsveiinsgrivttaiktllstvkydivksariyagqgytehqaqeewnmilhvlfeeetessassenihekndnetnectssfetlfeqepssevpkdsklymlaqktvqhieqygkapdfnkvirahnfiqtiygtplkeeekevvrlmvikx。
11、進一步所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體通過將所述的雜交瘤細胞注射balb/c小鼠，收集注射7～14?d后的腹水，經試劑盒純化后獲得。
12、一種抗非洲豬瘟病毒p30蛋白的片段化單克隆抗體f(ab’)2，其特征在于，所述f(ab’)2由所述的單克隆抗體經胃蛋白酶消化后所得。
13、一種檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于，該檢測方法通過所述的單克隆抗體或所述的f(ab’)2實現。
14、一種檢測非洲豬瘟病毒的elisa試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括所述的單克隆抗體或所述的f(ab’)2。
15、具體而言：
16、本專利技術提供了一種雜交瘤細胞，雜交瘤細胞保存號為cctcc?no:c2024103的雜交瘤細胞6e12。
17、本專利技術提供了一種抗非洲豬瘟病毒p30蛋白的單克隆抗體，由保藏號為cctcc?no:c2024103的雜交瘤細胞6e12分泌。且本專利技術提供的雜交瘤細胞可以穩定傳代，持續分泌抗p30單克隆抗體。
18、本專利技術提供的抗體在生物學功能上可特異性識別非洲豬瘟病毒p30蛋白，可用于western?blot及間接免疫熒光實驗。
19、本專利技術還提供了該非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體的亞型：重鏈為igg1型，輕鏈為κ型，同時也提供了抗體可變區序列。其中重鏈序列分別為vh-fr1，vh-cdr1，vh-fr2，vh-cdr2，vh-fr3，vh-cdr3和vh-fr4，輕鏈序列分別為vl-fr1，vl-cdr1，vl-fr2，vl-cdr2?,vl-fr3，vl-cdr3和vl-fr4。
20、vh-fr1(seq?no.2):?v?k?v?v?e?s?g?g?g?l?v?q?p?g?t?s?l?r?l?s?c?a?t?s
21、vh-cdr1(seq?no.3):?g?f?t?f?t?d?y?y
22、vh-fr2(seq?n0.4):?m?s?w?v?r?q?p?p?g?e?a?l?e?w?l?g?f
23、vh-cdr2(seq?no.5):?i?r?n?k?p?a?g?y?t?t
24、vh-fr3(seq?no.6):?e?y?s?a?s?v?k?g?r?f?t?i?s?r?d?n?s?q?s?i?l?y?l?q?l?nt?l?r?t?e?d?s?a?t?y?y?c
25、vh-cdr3(seq?no.7):?a?r?y?v?y?y?a?y?d?g?y?f?d?v
26、vh-fr4(seq?no.8):?w?g?a?g?t?t?v
27、vl-fr1(seq?no.9):?d?i?v?i?t?q?s?p?a?s?l?a?v?s?l?g?q?r?a?t?i?s?y?r?a?s
28、vl-cdr1(seq?no.10):?k?s?v?s?t?s?g?y?s?y
29、vl-fr2(seq本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由保藏號為CCTCC?NO:C2024103的雜交瘤細胞株產生。
2.根據權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區為VH-FR1、VH-CDR1、VH-FR2、VH-CDR2、VH-FR3、VH-CDR3和VH-FR4，其氨基酸序列如SEQ?IDNO.2-SEQ?ID?NO.8所示；輕鏈可變區為VL-FR1、VL-CDR1、VL-FR2、VL-CDR2、VL-FR3、VL-CDR3和VL-FR4，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9-SEQ?ID?NO.15所示。
3.根據權利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體的重鏈為IgG1型，輕鏈為κ型。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，由如下步驟制備獲得：非洲豬瘟病毒p30重組蛋白作為抗原，接種BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經過亞克隆篩選和間接ELISA鑒定后獲得雜交瘤細胞，單克隆抗體由所述的雜交瘤細胞產生；其中所述雜交瘤細胞的
5.?根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體通過將所述的雜交瘤細胞注射BALB/c小鼠，收集注射7～14?d后的腹水，經試劑盒純化后獲得。
6.一種抗非洲豬瘟病毒p30蛋白的片段化單克隆抗體F(ab’)2，其特征在于，所述F(ab’)2由權利要求1-3任一項所述的單克隆抗體經胃蛋白酶消化后所得。
7.一種檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于，該檢測方法通過權利要求1-3任意一項所述的單克隆抗體或權利要求6所述的F(ab’)2實現。
8.一種檢測非洲豬瘟病毒的ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括權利要求1-3任意一項所述的單克隆抗體或權利要求6所述的F(ab’)2。
...【技術特征摘要】
1.一種非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由保藏號為cctcc?no:c2024103的雜交瘤細胞株產生。
2.根據權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區為vh-fr1、vh-cdr1、vh-fr2、vh-cdr2、vh-fr3、vh-cdr3和vh-fr4，其氨基酸序列如seq?idno.2-seq?id?no.8所示；輕鏈可變區為vl-fr1、vl-cdr1、vl-fr2、vl-cdr2、vl-fr3、vl-cdr3和vl-fr4，其氨基酸序列如seq?id?no.9-seq?id?no.15所示。
3.根據權利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體的重鏈為igg1型，輕鏈為κ型。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，由如下步驟制備獲得：非洲豬瘟病毒p30重組蛋白作為抗原，接種balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭龍三，錢鶯娟，吳曉東，苗雨潤，
申請(專利權)人：南京農業大學三亞研究院，
類型：發明
國別省市：
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