【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及檢測，更具體地，本專利技術涉及一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置及其應用。
技術介紹
1、牛結節性皮膚病（lumpy?skin?disease，lsd）也叫牛結節性皮炎，牛疙瘩皮膚病，牛結節疹等，是由牛結節性皮膚病病毒（lumpy?skin?disease?virus，lsdv）感染牛后所致的急性、亞急性或慢性傳染病。目前，我國將牛結節性皮膚病由一類動物疫病調整為二類動物疫病。
2、lsdv屬于痘病毒科（poxvirdae），脊椎動物痘病毒亞科（chordopoxvirinae），山羊痘病毒屬（capripoxvirus，cpv），是線性雙鏈有囊膜的dna病毒，呈現典型的“磚型”或“大卵圓型”，其只有1個血清型，代表毒株為南非neethling株。由于capvs之間的交叉保護，來自綿羊或山羊的分離株可以交叉保護牛免受lsd感染，且lsdv分離株可以不同程度地保護綿羊和山羊免受綿羊痘病毒（sppv）和山羊痘病毒（gtpv）的感染。因此，目前疫苗免疫是牛結節性皮膚病的主要預防措施，常見的疫苗類型有同源性疫苗（lsdv弱毒活疫苗、滅活苗）、異源性疫苗（山羊痘疫苗、綿羊痘疫苗）。對大多數疫病而言，免疫抗體水平是評價免疫效果的參考指標，免疫效果中最能代表保護的抗體是中和抗體，但該病疫苗免疫后抗體水平存在較大差異，且大多養殖場設置在距離市區較偏遠的地區，不具備實驗室檢測條件，樣品采集后需經過特殊條件的保存和運輸，到達檢測機構才能進行檢測，即便有便攜的檢測設備，樣品也需要離心分離血清等前處理，操作
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供集采樣與檢測一體，且適用于檢測牛血清和血漿中lsdv中和抗體的便攜式免疫層析裝置，該裝置可對牛群免疫lsdv疫苗后的中和抗體水平進行評估，還可對lsdv感染情況進行輔助診斷，特別適用于養殖場等條件簡陋地區應用。
2、根據本專利技術的一個方面，提供了一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，包括前后一體連接的采樣主體和檢測主體，采樣主體內設有彈簧采樣器和虹吸管，彈簧采樣器包括采血針，采血針與虹吸管緊密貼合，檢測主體內設有前后依次連通的樣品前處理腔、濾膜、抗體富集腔和免疫層析檢測腔，虹吸管與樣品前處理腔相通，樣品前處理腔外側還設有稀釋液儲存腔和塑料針，稀釋液儲存腔與樣品前處理腔相連通，兩者之間被隔膜密封分隔，稀釋液儲存腔內保存有樣品稀釋液，塑料針位于稀釋液儲存腔內，并位于隔膜上方，抗體富集腔內設有吸液墊和層析墊，吸液墊的前后兩端分別與濾膜、層析墊相連接，免疫層析檢測腔內設有免疫層析試紙條，層析墊的前后兩端分別與吸液墊、免疫層析試紙條相連接。
3、在一些實施方式中，彈簧采樣器還包括按鈕和彈簧，彈簧的一端與采血針連接，另一端與按鈕連接，按鈕位于采樣主體的外側，采樣主體還設有可打開的保護蓋，采樣主體的一端設有采樣孔，保護蓋蓋設于采樣孔上，虹吸管的一端伸出采樣孔，并位于保護蓋內。
4、在一些實施方式中，免疫層析檢測腔還設有兩個環形卡扣和觀察窗，兩個環形卡扣均固定安裝于免疫層析檢測腔內，免疫層析試紙條的前后兩端分別被兩個環形卡扣卡裝固定，觀察窗設于免疫層析檢測腔的外殼，并位于免疫層析試紙條上方，便于對免疫層析試紙條的檢測結果進行觀察。
5、在一些實施方式中，免疫層析試紙條包括nc膜、金標墊、樣品墊、吸水墊和pvc底板，樣品墊、金標墊、nc膜、吸水墊依次搭接粘附在pvc底板上，nc膜上沿樣品流動方向包含依次設置的檢測線和質控線，金標墊上包含有膠體金標記的lsdv-a27l-063-1重組蛋白，檢測線上包被有抗牛的igg抗體，質控線上包被有針對lsdv-a27l-063-1重組蛋白的多克隆抗體，樣品墊伸入抗體富集腔內，并與層析墊搭接。
6、在一些實施方式中，樣品稀釋液為含有1wt%bsa、0.25wt%吐溫、0.1wt%海藻糖、1wt%甘油的0.01mm的pbs緩沖液，濾膜為無菌微孔濾膜、ptfe復合膜或紅細胞凝集素處理過的濾膜中的任意一種。
7、在一些實施方式中，層析墊浸泡有能與牛免疫球蛋白結合并充分包裹抗體fc段非特異結合位點的多肽，多肽的氨基酸序列為wpigrstetavl，層析墊在吸附多肽后，進行低溫干燥處理。
8、在一些實施方式中，lsdv-a27l-063-1重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no：10所示。
9、在一些實施方式中，制備lsdv-a27l-063-1重組蛋白的方法包括以下步驟：
10、s1.將seq?id?no：8所示的氨基酸序列通過柔性連接子與seq?id?no：2-3所示的氨基酸序列依次串聯，然后通過柔性連接子與seq?id?no：9所示的氨基酸序列、seq?id?no：5所示的氨基酸序列和seq?id?no：6所示的氨基酸序列依次串聯，得到如seq?id?no：10所示的氨基酸序列，即為lsdv-a27l-063-1重組蛋白；
11、s2.將seq?id?no：10所示的氨基酸序列經過密碼子優化后，得到如seq?id?no：11所示的核苷酸序列，將其插入至pfastbac1載體上，構建得到測序正確的重組質粒pfastbac-lsdv-a27l-063-1；
12、s3.將重組質粒pfastbac-lsdv-a27l-063-1轉入大腸桿菌dh10bac感受態細胞，進行培養、抽提及鑒定，得到重組桿狀病毒穿梭質粒bacmid-?lsdv-a27l-063-1；
13、s4.將重組桿狀病毒穿梭質粒bacmid-?lsdv-a27l-063-1轉染sf9細胞，培養，接種，得到重組桿狀病毒，對重組桿狀病毒進行誘導表達，分離純化后得到如seq?id?no：10所示氨基酸序列的lsdv-a27l-063-1重組蛋白，即檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的重組蛋白。
14、在一些實施方式中，多克隆抗體是由lsdv-a27l-063-1重組蛋白經動物免疫制備得到的。
15、根據本專利技術的另一個方面，提供了一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置在牛結節性皮膚病病毒中和抗體的非疾病診斷目的的免疫學檢測中的應用。
16、本專利技術的有益效果：1、本專利技術的便攜式免疫層析裝置集采樣與檢測于一體，省去了樣品前處理、保存及運輸等環節，節約了時間成本；而且檢測速度快、操作簡便，不需要專業人員操作，可應用于養殖場等條件簡陋地區，也可適用于疫病檢測機構、第三方檢測機構等對lsdv中和抗體進行大規模的檢測和監測，為lsdv疫情防控提供了更簡便、快捷的現場檢測裝置；
17、2、本專利技術的便攜式免疫層析裝置的采樣創口小，對牛群應激小，樣品稀釋液隔離式設置保證了對樣品的有效處理，抗體富集腔的設置提高了檢測的靈敏度和準確度，減少了非特異反應；
18、3、本專利技術便攜式免疫本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，包括前后一體連接的采樣主體和檢測主體，所述采樣主體內設有彈簧采樣器和虹吸管，所述彈簧采樣器包括采血針，所述采血針與所述虹吸管緊密貼合，所述檢測主體內設有前后依次連通的樣品前處理腔、濾膜、抗體富集腔和免疫層析檢測腔，所述虹吸管與所述樣品前處理腔相通，所述樣品前處理腔外側還設有稀釋液儲存腔和塑料針，所述稀釋液儲存腔與所述樣品前處理腔相連通，兩者之間被隔膜密封分隔，所述稀釋液儲存腔內保存有樣品稀釋液，所述塑料針位于所述稀釋液儲存腔內，并位于所述隔膜上方，所述抗體富集腔內設有吸液墊和層析墊，所述吸液墊的前后兩端分別與所述濾膜、所述層析墊相連接，所述免疫層析檢測腔內設有免疫層析試紙條，所述層析墊的前后兩端分別與所述吸液墊、所述免疫層析試紙條相連接。
2.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述彈簧采樣器還包括按鈕和彈簧，所述彈簧的一端與所述采血針連接，另一端與所述按鈕連接，所述按鈕位于所述采樣主體的外側，所述采樣主體還設有可打開的保護蓋，所述采樣主體的一端
3.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述免疫層析檢測腔還設有兩個環形卡扣和觀察窗，兩個所述環形卡扣均固定安裝于所述免疫層析檢測腔內，所述免疫層析試紙條的前后兩端分別被兩個所述環形卡扣卡裝固定，所述觀察窗設于所述免疫層析檢測腔的外殼，并位于所述免疫層析試紙條上方，便于對所述免疫層析試紙條的檢測結果進行觀察。
4.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述免疫層析試紙條包括NC膜、金標墊、樣品墊、吸水墊和PVC底板，所述樣品墊、金標墊、NC膜、吸水墊依次搭接粘附在PVC底板上，所述NC膜上沿樣品流動方向包含依次設置的檢測線和質控線，所述金標墊上包含有膠體金標記的LSDV-A27L-063-1重組蛋白，所述檢測線上包被有抗牛的IgG抗體，所述質控線上包被有針對LSDV-A27L-063-1重組蛋白的多克隆抗體，所述樣品墊伸入所述抗體富集腔內，并與所述層析墊搭接。
5.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述樣品稀釋液為含有1wt%BSA、0.25wt%吐溫、0.1wt%海藻糖、1wt%甘油的0.01mM的PBS緩沖液，所述濾膜為無菌微孔濾膜、PTFE復合膜或紅細胞凝集素處理過的濾膜中的任意一種。
6.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述層析墊浸泡有能與牛免疫球蛋白結合并充分包裹抗體Fc段非特異結合位點的多肽，所述多肽的序列為WPIGRSTETAVL，所述層析墊在吸附所述多肽后，進行低溫干燥處理。
7.根據權利要求4所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述LSDV-A27L-063-1重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：10所示。
8.根據權利要求7所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，制備權利要求7所述的LSDV-A27L-063-1重組蛋白的方法包括以下步驟：
9.根據權利要求7所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述多克隆抗體是由權利要求7所述的LSDV-A27L-063-1重組蛋白經動物免疫制備得到的。
10.權利要求1-9所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置在牛結節性皮膚病病毒中和抗體的非疾病診斷目的的免疫學檢測中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，包括前后一體連接的采樣主體和檢測主體，所述采樣主體內設有彈簧采樣器和虹吸管，所述彈簧采樣器包括采血針，所述采血針與所述虹吸管緊密貼合，所述檢測主體內設有前后依次連通的樣品前處理腔、濾膜、抗體富集腔和免疫層析檢測腔，所述虹吸管與所述樣品前處理腔相通，所述樣品前處理腔外側還設有稀釋液儲存腔和塑料針，所述稀釋液儲存腔與所述樣品前處理腔相連通，兩者之間被隔膜密封分隔，所述稀釋液儲存腔內保存有樣品稀釋液，所述塑料針位于所述稀釋液儲存腔內，并位于所述隔膜上方，所述抗體富集腔內設有吸液墊和層析墊，所述吸液墊的前后兩端分別與所述濾膜、所述層析墊相連接，所述免疫層析檢測腔內設有免疫層析試紙條，所述層析墊的前后兩端分別與所述吸液墊、所述免疫層析試紙條相連接。
2.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述彈簧采樣器還包括按鈕和彈簧，所述彈簧的一端與所述采血針連接，另一端與所述按鈕連接，所述按鈕位于所述采樣主體的外側，所述采樣主體還設有可打開的保護蓋，所述采樣主體的一端設有采樣孔，所述保護蓋蓋設于所述采樣孔上，所述虹吸管的一端伸出所述采樣孔，并位于所述保護蓋內。
3.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述免疫層析檢測腔還設有兩個環形卡扣和觀察窗，兩個所述環形卡扣均固定安裝于所述免疫層析檢測腔內，所述免疫層析試紙條的前后兩端分別被兩個所述環形卡扣卡裝固定，所述觀察窗設于所述免疫層析檢測腔的外殼，并位于所述免疫層析試紙條上方，便于對所述免疫層析試紙條的檢測結果進行觀察。
4.根據權利要求1所述的一種檢測牛結節性皮膚病病毒中和抗體的便攜式免疫層析裝置，其特征在于，所述免疫層析試紙條包括nc膜、金標墊、樣品墊、吸水墊和pvc底板，所述樣品墊、...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馮春燕，王彩霞，于浩洋，林祥梅，吳紹強，仇松寅，劉曉飛，梅琳，
申請(專利權)人：中國檢驗檢疫科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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