【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬藥物制備領域，具體涉及一種貽貝黏蛋白的提取純化方法。
技術介紹
1、貽貝黏蛋白是由海洋貽貝足絲腺分泌的黏性蛋白質，分子量分布為10～100kda，含有豐富的多巴基團，這些基團賦予了其強大的黏附性能和生物活性。這種蛋白質能夠有效地黏附在各種固體表面上，包括無機和有機表面，這使得它在表面化學、生物醫學和海洋工程等領域具有廣泛的應用。在生物醫學領域，貽貝黏蛋白因其抗炎、抗氧化、促進細胞貼壁爬行和創面愈合等功效而被廣泛應用。
2、目前天然貽貝黏蛋白的提取純化，是使用醋酸聯合變性劑(尿素、鹽酸胍等)進行組織勻漿、分離純化得到。然而，這種傳統方法普遍存在著提取得率低，得到的貽貝黏蛋白由于分子結構中氨基酸殘基的電荷、親水/疏水特性，導致其與外用涂敷類護膚產品、醫用敷料類產品中陰離子高分子成分存在配伍禁忌。有報道為避免配伍過程中出現物理性或化學性的相互作用，影響產品的功效，使用堿類物質將配伍后的沉淀通過調節消除，但經過調節后的貽貝黏蛋白與陰離子材料的復合物的結構特征是否完全恢復原始的狀態，并發揮其功能，尚未有試驗數據的支持。因此有必要提供一種貽貝黏蛋白得率高，同時不會與陰離子高分子成分存在配伍禁忌的貽貝黏蛋白制備方法。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種貽貝黏蛋白的提取純化方法，包括如下步驟：
2、1)取貽貝足腺，加提取液-1浸泡，均漿，沉淀，取沉淀物加提取液-2重懸，均漿，離心過濾，取濾液，得提取物；
3、2)取步驟1)所得
4、所述提取液-1是含50～150mm中性緩沖鹽、20～30mm?edta、0.5～1.5m氯化鈉、0.5～1.5mm苯甲磺酰氟、5～15mm?n-乙基馬來酰亞胺、25～75mm抗壞血酸的水溶液；
5、所述提取液-2是含1～10％酸、4～10m尿素、25～75mm抗壞血酸、20～50mm?edta、5～15mm?egta、0.5～1.5mm苯甲磺酰氟、5～15mm?n-乙基馬來酰亞胺、10～30mm谷胱甘肽和0.005～0.015％triton?x-100的水溶液。
6、進一步地，所述提取液-1是含50mm中性緩沖鹽、25mm?edta、1m氯化鈉、1mm苯甲磺酰氟、10mm?n-乙基馬來酰亞胺、50mm抗壞血酸的水溶液。
7、更進一步地，所述中性緩沖鹽包括磷酸鈉鹽、醋酸鹽、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、硼酸鈉鹽、碳酸鈉鹽，優選三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽。
8、進一步地，所述提取液-2是含5％酸、8m尿素、50mm抗壞血酸、25mm?edta、10mmegta、1mm苯甲磺酰氟、10mm?n-乙基馬來酰亞胺、20mm谷胱甘肽和0.01％triton?x-100的水溶液。
9、更進一步地，所述酸包括檸檬酸、醋酸，優選醋酸。
10、進一步地，步驟1)所述貽貝足絲與提取液-1的質量體積比為1g：5～20ml；所述貽貝足腺包括貽貝足絲和/或足絲腺體；
11、所述浸泡的時間為30～120分鐘；
12、所述均漿的轉速5000-20000rpm，時間5～30分鐘；
13、所述沉淀物與提取液-2的質量體積比為1g：5～7.5ml；
14、所述離心的速度10000g以上；
15、所述過濾是用5～100微米濾紙和/或0.5～5微米濾芯過濾。
16、進一步地，步驟2)所述純化的方法為透析法；
17、所述透析法是提取物置于透析袋內，用透析液進行透析，取透析后袋內溶液過濾，收集濾液，即可；
18、所述透析液由1#～5#透析液組成；每一種透析液至少透析兩次，每次的透析時間大于5個小時；
19、所述1#透析液是含3～7％醋酸、6m尿素和輔助成分的水溶液；2#透析液是含3～7％醋酸、4m尿素和輔助成分的水溶液；3#透析液是含3～7％醋酸、2m尿素和輔助成分的水溶液；4#透析液是含3～7％醋酸和輔助成分的水溶液；5#透析液是含0.5～1.5％檸檬酸和輔助成分的水溶液；
20、所述透析液中的輔助成分為5～15mm?edta、6～10mm?egta、0.5～1.5mm苯甲磺酰氟、10～30mm?n-乙基馬來酰亞胺、0.005～0.015％triton?x-100。
21、更進一步地，所述提取物與透析液的體積比為1：200～1000；
22、所述1#透析液是含5％醋酸、6m尿素和輔助成分的水溶液；2#透析液是含5％醋酸、4m尿素和輔助成分的水溶液；3#透析液是含5％醋酸、2m尿素和輔助成分的水溶液；4#透析液是含5％醋酸和輔助成分的水溶液；5#透析液是含1％檸檬酸和輔助成分的水溶液；
23、所述透析液中的輔助成分為10mm?edta、8mm?egta、1mm苯甲磺酰氟、20mm?n-乙基馬來酰亞胺、0.01％?triton?x-100；
24、所述過濾是用0.5?-5微米的聚醚砜材質濾芯進行過濾。
25、進一步地，步驟2)所述純化的方法為沖洗法；
26、所述沖洗法是提取物置于切向流系統中，用沖洗液沖洗，取沖洗后系統中溶液，即可；
27、所述沖洗液由沖洗液-1和沖洗液-2組成；沖洗液-1沖洗1～6h，再用沖洗液-2沖洗0.5～3h；
28、所述沖洗液-1是含3～8％醋酸、2～5m尿素和輔助成分的水溶液，沖洗液-2是含0.5～1.5％檸檬酸、10～30mm谷胱甘肽和輔助成分的水溶液；
29、所述沖洗液中的輔助成分為5～15mm的edta、6～10mm的egta、0.5～1.5mm的苯甲磺酰氟、15～25mm的n-乙基馬來酰亞胺、0.03～0.08％triton?x-100。
30、更進一步地，所述切向流系統中濾膜為聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜或聚酰胺膜；
31、所述提取物與沖洗液的體積比為1：2～20；
32、所述沖洗液-1是含5％醋酸、3m尿素和輔助成分的水溶液，沖洗液-2是含1％檸檬酸、20mm谷胱甘肽和輔助成分的水溶液；
33、所述沖洗液中的輔助成分為10mm的edta、8mm的egta、1mm的苯甲磺酰氟、20mm的n-乙基馬來酰亞胺、0.05％triton?x-100。
34、本專利技術最后提供了一種貽貝黏蛋白提取物，它是按照前述提取純化方法制備而成。
35、本專利技術貽貝黏蛋白的提取純化方法，通過特定的提取液提取，再以特定的純化方法得到的貽貝黏蛋白，其中蛋白和多巴含量高，且能與陰離子高分子成分卡波姆、透明質酸鈉、羧甲基纖維素鈉等藥物輔料配伍，用于藥品或護膚品的制備，應用前景廣泛。
36、顯然，根據本專利技術的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本專利技術上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
37、以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種貽貝黏蛋白的提取純化方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述提取液-1是含50mM中性緩沖鹽、25mM?EDTA、1M氯化鈉、1mM苯甲磺酰氟、10mM?N-乙基馬來酰亞胺、50mM抗壞血酸的水溶液。
3.根據權利要求2所述的提取純化方法，其特征在于：所述中性緩沖鹽包括磷酸鈉鹽、醋酸鹽、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、硼酸鈉鹽、碳酸鈉鹽，優選三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽。
4.根據權利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述提取液-2是含5％酸、8M尿素、50mM抗壞血酸、25mM?EDTA、10mM?EGTA、1mM苯甲磺酰氟、10mM?N-乙基馬來酰亞胺、20mM谷胱甘肽和0.01％Triton?X-100的水溶液。
5.根據權利要求4所述的提取純化方法，其特征在于：所述酸包括檸檬酸、醋酸，優選醋酸。
6.根據權利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：步驟1)所述貽貝足絲與提取液-1的質量體積比為1g：5～20mL；所述貽貝足腺包括貽貝足絲和/或足絲腺體；
7.
8.根據權利要求7所述的提取純化方法，其特征在于：所述提取物與透析液的體積比為1：200～1000；
9.根據權利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：步驟2)所述純化的方法為沖洗法；
10.一種貽貝黏蛋白提取物，其特征在于：它是按照權利要求1～9任一項所述提取純化方法制備而成。
...【技術特征摘要】
1.一種貽貝黏蛋白的提取純化方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述提取液-1是含50mm中性緩沖鹽、25mm?edta、1m氯化鈉、1mm苯甲磺酰氟、10mm?n-乙基馬來酰亞胺、50mm抗壞血酸的水溶液。
3.根據權利要求2所述的提取純化方法，其特征在于：所述中性緩沖鹽包括磷酸鈉鹽、醋酸鹽、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、硼酸鈉鹽、碳酸鈉鹽，優選三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽。
4.根據權利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述提取液-2是含5％酸、8m尿素、50mm抗壞血酸、25mm?edta、10mm?egta、1mm苯甲磺酰氟、10mm?n-乙基馬來酰亞胺、20mm谷胱甘肽和0.01％triton?x-10...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡博志，鄭宏宇，余嬌，蘭增金，
申請(專利權)人：藍佳堂生物醫藥福建有限公司，
類型：發明
國別省市：
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