【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及體外診斷，具體涉及一種用于直腸癌早期篩查的組合物、試劑盒以及直腸癌早期血液kcnq5基因甲基化檢測的方法。
技術介紹
1、直腸癌(colorectalcancer，crc)是來源于結直腸黏膜上皮的癌性病變，根據截至2024年1月最新發布的美國癌癥數據，結直腸癌在美國癌癥發病率中排名第三，同時也是導致癌癥患者死亡的第二大癌癥。crc預后與早期診斷密切相關，大多數早期crc可以治愈，5年生存率可達90％，而晚期則不足10％。目前對于結直腸癌診斷的金標準仍是結腸鏡與活檢，但基于這項檢查的侵入性、術前漫長的腸道準備及高昂的價格，使得這項檢查的接受度與參與率均較低，如何篩選出高危人群進行結腸鏡檢查是提高crc早期診斷率的重點。由于crc具有較強的隱匿性，現階段的早期檢出率僅為5％至10％，這大大影響了疾病的診斷和治療效果。因此，臨床上迫切需要一種高效且便捷的crc早期篩查方法。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術的目的在于提供用于血液kcnq5基因甲基化檢測的方法和試劑盒，所述血液kcnq5基因甲基化檢測的試劑盒檢測結果準確，且為達到上述技術效果，本專利技術提供一種用于腸癌早期篩查的組合物，包括kcnq5靶標特異引物對、kcnq5特異性引物探針、內參引物對以及內參引物探針，其中，
2、所述kcnq5特異性引物探針序列的第二cg位點的胞嘧啶為甲基化胞嘧啶，所述第二第二cg位點為6號染色體上的72623235、72623236位點。
3、需要說
4、作為一種用于腸癌早期篩查的組合物的優選技術方案，kcnq5靶標特異引物對的序列如下：
5、正向引物：5’-ggagaaggtggttaaggtttagag-3'；
6、反向引物：5’-tacgcttctactatcgcacct-3'；
7、kcnq5特異性引物探針的序列如下：
8、5’-acgttacttcgcctaacctactaacctc-3'；
9、內參引物對的序列如下：
10、正向引物：5’-gtgatggaggaggtttagtaa-3'；
11、反向引物：5’-ccaataaaacctactcctccct-3'；
12、內參引物探針的序列如下：
13、5’-cacccaacacacaataacaaacaca-3'。
14、需要說明的是，該技術方案通過精確設計的引物對和探針，實現了kcnq5基因甲基化狀態在腸癌早期篩查中的高效檢測。kcnq5靶標特異引物對的正向引物和反向引物能夠特異性結合目標基因的靶標區域，引導qpcr擴增產生足夠的目標片段；kcnq5特異性引物探針靶向擴增片段中關鍵的甲基化敏感位點，其設計確保了探針能夠精確區分甲基化和未甲基化序列，并通過熒光信號反映目標片段的擴增情況，從而提升檢測的靈敏度和特異性。與此同時，內參引物對和內參探針的引入，通過擴增和監測內參基因信號，為檢測體系提供校正基準，有效消除了樣本濃度差異或擴增效率波動的影響。這種引物和探針的協同作用，不僅實現了目標基因甲基化dna的高靈敏檢測，還確保了檢測體系的可靠性，使該方法在腸癌早期篩查中展現出顯著的技術優勢。
15、同時，本專利技術還提供了一種用于腸癌早期篩查的試劑盒，包括上述用于腸癌早期篩查的組合物。
16、第二方面，本專利技術還提供了一種腸癌早期血液kcnq5基因甲基化檢測的方法，包括如下技術步驟：
17、采用用于腸癌早期篩查的試劑盒對kcnq5基因甲基化進行檢測；
18、從血漿中提取總cfdna；
19、加入亞硫酸鹽與cfdna孵育，使甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶；
20、加入qpcr引物進行擴增，收集特異引物組fam信號以及內參引物cy-5信號，通過計算特異引物與內參引物ct值之差得到δct，以此判斷血液kcnq5基因甲基化水平。
21、需要說明的是，該方法通過一系列精確的技術步驟實現了腸癌早期篩查中kcnq5基因甲基化的高效檢測。首先，采用專門設計的試劑盒對血液樣本中的kcnq5基因甲基化進行檢測。然后，從血漿中提取總cfdna(循環游離dna)，該dna通常源自細胞凋亡或壞死，攜帶有腫瘤相關的表觀遺傳信息。在提取的cfdna中，未甲基化的胞嘧啶將通過亞硫酸鹽處理轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，這一步驟確保了甲基化狀態與未甲基化狀態的可區分性。接下來，加入專門設計的qpcr引物進行擴增，其中特異引物組與內參引物分別靶向kcnq5基因區域和內參基因區域，通過qpcr的實時監測收集fam信號(來自特異引物)和cy-5信號(來自內參引物)。最后，通過計算特異引物與內參引物ct值之差(δct)，進一步分析kcnq5基因的甲基化水平。δct值的大小直接反映了kcnq5基因的甲基化狀態，較小的δct值表示較高的甲基化水平，提供了精確的定量信息，用于早期篩查腸癌的風險。這一技術流程結合了高靈敏度和特異性的qpcr技術，使得血液樣本中的kcnq5基因甲基化檢測更加準確、可靠，具有很高的臨床應用潛力。
22、作為一種腸癌早期血液kcnq5基因甲基化檢測的方法的優選技術方案，通過計算特異引物與內參引物ct值之差得到δct，以此判斷血液kcnq5基因甲基化水平，包括：
23、若特異引物與內參引物ct值之差得到δct值＜8.09，可判斷kcnq5基因甲基化陽性；
24、若特異引物與內參引物ct值之差得到δct值≥8.09或檢測不到熒光信號，則判斷為kcnq5基因甲基化陰性。
25、需要說明的是，該優選技術方案通過計算特異引物與內參引物ct值之差(δct)來定量判斷血液中kcnq5基因甲基化水平，實現精確的早期篩查。當δct值＜8.09時，表明kcnq5基因的甲基化水平較高，因此可以判斷為kcnq5基因甲基化陽性，這通常意味著腸癌相關的表觀遺傳變化已經發生，可能存在腸癌的早期風險；而當δct值≥8.09或檢測不到熒光信號時，表明kcnq5基因未表現出明顯的甲基化變化，因此判斷為kcnq5基因甲基化陰性，這意味著血液樣本中未能檢測到腸癌相關的甲基化標志。通過這種本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于腸癌早期篩查的組合物，其特征在于，包括KCNQ5靶標特異引物對、KCNQ5特異性引物探針、內參引物對以及內參引物探針，其中，所述KCNQ5特異性引物探針序列的第二個CG位點的胞嘧啶為甲基化胞嘧啶，所述第二CG位點為6號染色體上的72623235、72623236位點。
2.根據權利要求1所述的用于腸癌早期篩查的組合物，其特征在于，KCNQ5靶標特異引物對的序列如下：
3.一種用于腸癌早期篩查的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的用于腸癌早期篩查的組合物。
4.一種腸癌早期血液KCNQ5基因甲基化檢測的方法，其特征在于，包括如下技術步驟：
5.根據權利要求4所述的腸癌早期血液KCNQ5基因甲基化檢測的方法，其特征在于，通過計算特異引物與內參引物ct值之差得到ΔCt，以此判斷血液KCNQ5基因甲基化水平，包括：
6.如權利要求3所述的用于腸癌早期篩查的試劑盒在用于篩查、診斷、治療癌癥疾病中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述腸癌包括直腸癌、結腸癌。
【技術特征摘要】
1.一種用于腸癌早期篩查的組合物，其特征在于，包括kcnq5靶標特異引物對、kcnq5特異性引物探針、內參引物對以及內參引物探針，其中，所述kcnq5特異性引物探針序列的第二個cg位點的胞嘧啶為甲基化胞嘧啶，所述第二cg位點為6號染色體上的72623235、72623236位點。
2.根據權利要求1所述的用于腸癌早期篩查的組合物，其特征在于，kcnq5靶標特異引物對的序列如下：
3.一種用于腸癌早期篩查的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的用于腸癌...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫海波，李辰雨，朱群山，劉晨旭，
申請(專利權)人：南京捷因診斷技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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