【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子標記，具體涉及一種鑒定木槿品種雜交后代的ssr標記引物組及檢測方法。
技術介紹
1、木槿(hibiscussyriacus?linn)是錦葵科(malvaceae)木槿屬(hibiscus)落葉灌木，別名朝天暮落花、荊條、籬障花等，原產于我國中部，除華北、西北、東北的部分地區外，國內均有分布。全球范圍內，約有200種木槿屬植物，在中國分布的有25種，其中包括13種木本植物。木槿在夏秋季節開花，花期較長，花朵大且顏色鮮艷，常作園林觀花類觀賞樹種，還具有藥用價值。木槿有很強的滯塵功能，同時對二氧化硫與氯化物等有害氣體具有很強的抗性，常被用作有污染工廠的綠化樹種。
2、目前，對木槿的研究主要集中在繁殖技術、遺傳多樣性和遺傳結構研究。分子標記應用方面，主要涉及以下方面：1.應用srap標記鑒定親緣關系，2.利用issr分子標記對木槿屬植物進行了遺傳多樣性分析，3.基于rapd法分析木槿品種的遺傳關系，4.應用est-ssr構建木槿品種的dna指紋圖譜。總體來說，木槿分子標記相關研究相對滯后，已有的分子標記無法滿足木槿遺傳育種研究需求。雜交育種是木槿新種質創制、新品種培育的主要途徑之一，木槿的雜交后代變異豐富，具有良好的觀賞性，有些雜交后代個體的葉片等營養器官兼有父母本的特征；有些個體的形態特征和母本近似，無明顯差異，無法通過形態學特征進行鑒定，加之周期太長，且受生長發育和環境的影響，一定程度上限制了雜交后代的準確、快速鑒定。因此，急需篩選針對不同親本組合的新型分子標記，建立快速、準確、高效的木槿雜交后代分子
技術實現思路
1、為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種鑒定木槿品種雜交后代的ssr標記引物組合及檢測方法，分子標記技術不受植物發育時期和環境的影響，僅需微量新鮮組織或硅膠快速干燥組織樣品便可準確高效檢測植物品種或兩個親本的雜交子一代(f1)。基于轉錄組測序技術，挖掘適用于木槿雜交f1代鑒定的簡單重復序列(simple?sequencerepeats，ssr)長度多態性位點，篩選可用于鑒定雜交后代的ssr標記，然后利用木槿親本及其雜交f1代的基因組dna對候選標記進行驗證，獲得特異性好、分辨率高的標記，達到快速、準確鑒定f1代的目的。
2、為達到上述目的，本方案首先提供了一種鑒定木槿品種雜交后代的ssr標記引物組，所述ssr標記引物組包括hbg7、hbg18、hbg21；
3、所述hbg7的引物組序列如seq?id?no.1～seq?id?no.2所示；
4、所述hbg18的引物組序列如seq?id?no.3～seq?id?no.4所示；
5、所述hbg21的引物組序列如seq?id?no.5～seq?id?no.6所示。
6、基于一個總的專利技術構思，本方案還提供了一種鑒定木槿品種雜交后代的ssr標記引物組的檢測方法，包括以下步驟：
7、s1、以木槿父本、木槿母本和待測木槿品種雜交f1代的新鮮組織或硅膠快速干燥組織樣品為待測樣本，采用改良ctab法提取樣本的總dna；
8、s2、以s1步驟中得到的總dna為模板，以hbg18、hbg21或hbg7?ssr標記引物組作為擴增引物進行pcr擴增；
9、s3、對s2步驟擴增產物進行序列分析，對擴增產物是否具有特異性條帶判斷待測f1代是否為雜交f1代。作為優選，所述木槿父本、木槿母本分別為‘玫瑰木槿’和‘中國雪紡’時，采用hbg18為標記引物組，若pcr擴增產物具有父本和母本的特異性條帶，則待測f1代為‘玫瑰木槿’和‘中國雪紡’的雜交后代。
10、作為優選，所述木槿父本、木槿母本分別為‘藍鳥’和‘漢帛’時，采用hbg18為標記引物組，若pcr擴增產物具有父本的特異性條帶，則待測f1代為‘藍鳥’和‘漢帛’的雜交后代。
11、作為優選，所述木槿父本、木槿母本分別為‘粉紅心重瓣’和‘中國雪紡’時，采用hbg7為標記引物組，若pcr擴增產物同時具有父本和母本的特異性條帶，則待測f1代為‘粉紅心重瓣’和‘中國雪紡’的雜交后代。
12、作為優選，所述木槿父本、木槿母本分別為‘普粉’和‘紅心’時，采用hbg21為標記引物組，若pcr擴增產物具有父本的特異性條帶，則待測f1代為‘普粉’和‘紅心’的雜交后代。
13、作為優選，所述木槿父本、木槿母本分別為‘藍色雪紡’和‘長苞重瓣’時，采用hbg21為標記引物組，若pcr擴增產物具有父本的特異性條帶，則待測f1代為‘藍色雪紡’和‘長苞重瓣’的雜交后代。
14、作為優選，所述s2步驟中pcr擴增的體系為：木槿親本或待測試材料的dna模板1μl(約20ng)，10μmol/l的上、下游引物各1μl，2×taq?master?mix?10μl，ddh2o?7μl，體系總體積為20μl。
15、作為優選，所述pcr擴增的程序為：
16、(1)hbg7標記的pcr反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35次循環；72℃延伸5min，4℃保存；
17、(2)hbg18標記的pcr反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸30s，35次循環；72℃延伸5min，4℃保存；
18、(3)hbg21標記的pcr反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸30s，35次循環；72℃延伸5min，4℃保存
19、本方案鑒定的方法如下：
20、應用本方案中的ssr標記hbg18對父本‘玫瑰木槿’和母本‘中國雪紡’雜交組合、父本‘藍鳥’和母本‘漢帛’雜交組合后代進行了pcr檢測，應用ssr標記hbg7對父本‘粉紅心重瓣’和母本‘中國雪紡’雜交組合進行了pcr檢測，應用ssr標記hbg21對父本‘普粉’和母本‘紅心’雜交組合、父本‘藍色雪紡’和母本‘長苞重瓣’雜交組合進行了pcr檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明3個ssr標記均可準確區分木槿親本和其雜交子代，達到了快速鑒定雜交f1代的目的。
21、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
22、現有檢測技術為形態學鑒定，主要通過葉片、枝條、花朵和果實等組織器官的特征加以區分，周期較長，且受時間和植物生長發育階段的限制，無法滿足快速、準確鑒定雜交f1代的需要，本方案采用ssr標記鑒定雜交f1代，不受植物發育時期、生長階段和環境影響，僅需微量新鮮組織或硅膠快速干燥組織樣品便可準確、快速地鑒定待測樣品，在儀器設備齊全的前提下，僅需4小時左右便可得到檢測結果。
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1.一種鑒定木槿品種雜交后代的SSR標記引物組，其特征在于，所述SSR標記引物組包括HBG7、HBG18、HBG21；
2.一種如權利要求1所述的鑒定木槿品種雜交后代的SSR標記引物組的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述木槿父本、木槿母本分別為‘玫瑰木槿’和‘中國雪紡’時，采用HBG18為標記引物組，若PCR擴增產物具有父本和母本的特異性條帶，則待測F1代為‘玫瑰木槿’和‘中國雪紡’的雜交后代。
4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述木槿父本、木槿母本分別為‘藍鳥’和‘漢帛’時，采用HBG18為標記引物組，若PCR擴增產物具有父本的特異性條帶，則待測F1代為‘藍鳥’和‘漢帛’的雜交后代。
5.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述木槿父本、木槿母本分別為‘粉紅心重瓣’和‘中國雪紡’時，采用HBG7為標記引物組，若PCR擴增產物同時具有父本和母本的特異性條帶，則待測F1代為‘粉紅心重瓣’和‘中國雪紡’的雜交后代。
6.根據權利要求2所述的檢測方法，其
7.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述木槿父本、木槿母本分別為‘藍色雪紡’和‘長苞重瓣’時，采用HBG21為標記引物組，若PCR擴增產物具有父本的特異性條帶，則待測F1代為‘藍色雪紡’和‘長苞重瓣’的雜交后代。
8.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述S2步驟中PCR擴增的體系為：木槿親本或待測試材料的DNA模板1μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2×Taq?Master?Mix?10μL，ddH2O?7μL，體系總體積為20μL。
9.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序為：
...【技術特征摘要】
1.一種鑒定木槿品種雜交后代的ssr標記引物組，其特征在于，所述ssr標記引物組包括hbg7、hbg18、hbg21；
2.一種如權利要求1所述的鑒定木槿品種雜交后代的ssr標記引物組的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述木槿父本、木槿母本分別為‘玫瑰木槿’和‘中國雪紡’時，采用hbg18為標記引物組，若pcr擴增產物具有父本和母本的特異性條帶，則待測f1代為‘玫瑰木槿’和‘中國雪紡’的雜交后代。
4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述木槿父本、木槿母本分別為‘藍鳥’和‘漢帛’時，采用hbg18為標記引物組，若pcr擴增產物具有父本的特異性條帶，則待測f1代為‘藍鳥’和‘漢帛’的雜交后代。
5.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述木槿父本、木槿母本分別為‘粉紅心重瓣’和‘中國雪紡’時，采用hbg7為標記引物組，若pcr擴增產物同時具有父本和...
【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴佳文，陽秀玫，黃雅奇，舒東膂，王思瑤，鄭碩理，陳白冰，黃程前，
申請(專利權)人：湖南省植物園，
類型：發明
國別省市：
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