【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種乳酸菌信號分子ai-2轉運蛋白及編碼基因和應用。
技術介紹
1、乳酸菌群體感應（quorum?sensing，qs）系統是乳酸菌依賴群體密度，通過信號分子的產生、釋放、積累和感應進行化學交流，最終表現出多個細菌合作完成特定生理功能的種群密度依賴的基因表達調控系統，在乳酸菌生理調控中發揮著重要作用。luxs/ai-2-qs系統是乳酸菌中的重要系統，承載著乳酸菌中多種行為的信號傳遞與交流，該系統不僅對調控功能因子的形成起著重要作用，而且對調控菌株的抗逆性起重要作用。
2、ai-2（autoinducer-2）是介導luxs/ai-2群體感應系統的通用信號分子，承載著乳酸菌中多種行為的信號傳遞與交流。首先，乳酸菌自身自己編碼信號分子ai-2的合成的luxs基因和luxs蛋白，合成的信號分子ai-2通過轉運蛋白運輸到胞外，當胞外的ai-2到達一定的濃度時，ai-2通過與細胞膜上的受體蛋白結合，內化到胞內，從而調控下游基因和蛋白的表達，最終調控乳酸菌生物膜、胞外多糖、細菌素等功能因子的合成。研究表明，luxs/ai-2群體感應系統通過介導wzx/wzy途徑調控發酵粘液乳桿菌a51胞外多糖的合成，然而關鍵的信號分子ai-2轉運蛋白尚不明確。
3、信號分子ai-2轉運蛋白是細胞膜上與信號分子ai-2相結合的一類跨膜蛋白，研究發現，信號分子ai-2轉運蛋白在乳酸菌的生理調節和功能因子合成過程中發揮著極其重要的作用。信號分子ai-2必須與相應的轉運蛋白結合才能轉運至胞外，從而激活luxs/a
技術實現思路
1、針對上述問題，本專利技術旨在提供一種乳酸菌信號分子ai-2轉運蛋白及其編碼基因a0a1l7gxs4在合成信號分子ai-2轉運蛋白中的應用。
2、本專利技術提供一種乳酸菌信號分子ai-2轉運蛋白，所述轉運蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。本專利技術提供的乳酸菌信號分子ai-2轉運蛋白在發酵粘液乳桿菌a51中克隆得到，該菌株的保藏編號為cctcc?no：m2023861，在現有專利cn116769673a中已經公開保藏。
3、本專利技術還提供所述乳酸菌信號分子ai-2轉運蛋白的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
4、本專利技術還提供一種含有所述編碼基因的重組質粒。
5、作為優選，所述重組質粒由信號分子ai-2轉運蛋白的編碼基因與pet-22b載體同源重組獲得，命名為pet-22b-xs4-his。
6、本專利技術還提供一種轉基因工程菌，所述基因工程菌含有所述重組質粒，或所述基因工程菌的基因組中整合有所述的編碼基因。
7、作為對上述方案的進一步描述：所述轉基因工程菌為大腸桿菌bl21（de3）菌株。
8、本專利技術還提供所述轉運蛋白在促進信號分子ai-2由胞內向胞外轉運或促進信號分子ai-2合成中的應用；所述轉運蛋白可以應用于乳酸菌的群體感應系統，實現信號分子ai-2由胞內向胞外的轉運，激活luxs/ai-2群體感應系統，定向調控乳酸菌胞外多糖等功能因子的合成。
9、本專利技術還提供一種乳酸菌信號分子ai-2轉運蛋白的合成方法，所述方法包括以下步驟：
10、步驟（1）目的基因cdna模板的制備；
11、步驟（2）以所述cdna為模板，采用dna聚合酶進行目的基因擴增和回收；
12、步驟（3）基因重組載體的構建與鑒定；
13、步驟（4）重組蛋白表達和純化；
14、步驟（5）重組蛋白結合ai-2能力的測定；
15、所述步驟（3）中基因重組載體的構建與鑒定包括載體線性化和基因重組：所述載體線性化是利用bamhi和ndei雙酶對pet-22b載體進行酶切得到線性化載體pet-22b，使用試劑盒進行純化回收；所述基因重組是將試劑盒擴增得到的目的基因與線性化的pet-22b載體連接，轉化菌株為e.coli?bl21(de3)感受態細胞，得到含有所述轉運蛋白的菌液。
16、作為對上述方案的進一步描述：所述步驟（1）中cdna模板的制備操作如下：取保藏編號為cctcc?no：m2023861的發酵粘液乳桿菌懸浮液離心，離心后的菌泥經液氮速凍后進行rna提取，使用takara反轉錄試劑盒將rna反轉錄成cdna。
17、作為對上述方案的進一步描述：所述步驟（4）中蛋白表達和純化步驟如下：取所述菌液復蘇培養，并接種至新鮮的lb液體培養基擴大培養，培養液中加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）在低溫條件下進行蛋白誘導表達；誘導表達結束后，離心收集菌體，緩沖液重懸菌體，超聲破碎，高速離心，取上清液加載到his親和層析柱，利用不同濃度的咪唑過柱洗脫并收集濾液，將洗脫液與沉淀用sds-page蛋白電泳檢測結果。
18、所述步驟（5）中重組蛋白結合ai-2能力的測定包括以下步驟：測定重組蛋白結合和釋放信號分子ai-2的能力，以及通過表面等離子共振技術spr測定重組蛋白與ai-2的結合能。
19、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
20、（1）本專利技術首次發現了一種信號分子ai-2轉運蛋白a0a1l7gxs4；本專利技術通過重組質粒、體外克隆、表達純化，能夠實現ai-2轉運蛋白a0a1l7gxs4的快速、高效表達，能夠用于促進ai-2的合成。
21、（2）乳酸菌信號分子ai-2轉運蛋白基因的研究及其體外合成，將為乳酸菌功能因子合成、生理調控及ai-2轉運蛋白功能的研究奠定基礎，也將為定向調控乳酸菌合成功能因子提供新的方向。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種乳酸菌信號分子AI-2轉運蛋白，其特征在于，所述轉運蛋白的氨基酸序列如SEQID?NO.1所示。
2.一種如權利要求1所述的乳酸菌信號分子AI-2轉運蛋白的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
3.一種含有權利要求2所述的編碼基因的重組質粒。
4.如權利要求3所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒由信號分子AI-2轉運蛋白的編碼基因與pET-22b載體同源重組獲得，命名為pET-22b-XS4-His。
5.一種轉基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有權利要求3或4所述的重組質粒，或所述基因工程菌的基因組中整合有權利要求2所述的編碼基因。
6.如權利要求5所述的轉基因工程菌，其特征在于，所述轉基因工程菌為大腸桿菌BL21菌株。
7.如權利要求1所述的轉運蛋白在促進信號分子AI-2由胞內向胞外轉運或促進信號分子AI-2合成中的應用。
8.一種如權利要求1所述的乳酸菌信號分子AI-2轉運蛋白的合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。