【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種多酶輔助的用于邏輯檢測外泌體mirnas的熒光生物傳感器。
技術(shù)介紹
1、外泌體micrornas?(mirnas)是一類小的非編碼rna，廣泛參與調(diào)節(jié)基因表達，并與疾病的發(fā)生和進展密切相關(guān)。與外周血mirnas相比，外泌體mirnas由于其良好的循環(huán)穩(wěn)定性，在腫瘤早期診斷中顯示出更大的應(yīng)用潛力。然而，復(fù)雜的癌癥狀況導(dǎo)致外泌體的表型異質(zhì)性，使得依賴單個外泌體mirna來準(zhǔn)確診斷和監(jiān)測疾病具有挑戰(zhàn)性。通過提高靶點的可及性，各種外泌體mirna的邏輯譜分析可以檢測到微小的濃度變化，比單信號傳感揭示更多的未知信息，可以有效提高檢測靈敏度，減少假陽性/陰性結(jié)果，從而提高其臨床診斷價值。目前，檢測外泌體mirnas最主要的方法是實時熒光定量pcr，但該方法嚴重依賴復(fù)雜精密的儀器，昂貴的試劑和熟練的技術(shù)操作，給檢測的廣泛應(yīng)用帶來了巨大的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要開發(fā)一種分析外泌體mirnas的多重平臺，實現(xiàn)簡單快速的外泌體mirnas的檢測。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種多酶輔助的用于邏輯檢測外泌體mirnas的熒光生物傳感器。
2、為達到上述目的，本專利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：
3、一種多酶輔助的用于邏輯檢測外泌體mirnas的熒光生物傳感器
4、所述熒光生物傳感器包括crispr/cas13a蛋白體系、dna聚合酶驅(qū)動的引物交換反應(yīng)體系和核酸外切酶反應(yīng)體系；
5、所述crispr
6、所述dna聚合酶驅(qū)動的引物交換反應(yīng)體系包括bst3.0?dna聚合酶及其緩沖液、發(fā)夾h2和dntp；所述發(fā)夾h2的3’端部分凸出八個堿基長的單鏈dna，作為觸發(fā)引物交換反應(yīng)的dna引物p1的互補識別區(qū)；發(fā)夾h2?3’端修飾倒置的t堿基以防止非特異性延伸，發(fā)夾h2莖稈末端g-c堿基對進行羥甲基化修飾以阻止聚合酶的延伸；在bst3.0?dna聚合酶的幫助下，引物p1以發(fā)夾h2的莖稈部分為模板，向前復(fù)制延伸，直到在羥甲基化修飾的位點終止，生成引物延伸序列p2，發(fā)夾h2上的互補序列通過競爭將引物延伸序列p2從h2上置換下去，從而參與下一步反應(yīng)；
7、核酸外切酶反應(yīng)體系包括發(fā)夾h3、核酸外切酶iii及其緩沖液；所述發(fā)夾h3的5’端修飾熒光基團，與之堿基互補的3’端堿基修飾熒光淬滅基團，發(fā)夾h3的3’端凸出多個堿基以dna單鏈的形式存在，既充當(dāng)上一步反應(yīng)產(chǎn)生的引物延伸序列p2的識別區(qū)，又可以防止核酸外切酶iii的非特異性消化；從上一步引物交換反應(yīng)產(chǎn)生的引物延伸序列p2與h3的單鏈部分互補結(jié)合形成雙鏈dna，觸發(fā)核酸外切酶iii的切割，從雙鏈dna的3’端向前切割，直到在單鏈部分切割終止，最終導(dǎo)致p2被釋放參與下一個切割循環(huán)，h3的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，熒光基團遠離猝滅基團，產(chǎn)生熒光信號；
8、發(fā)夾h1的核苷酸序列為tctacacguuuuucgtgtaga；
9、引物p1的核苷酸序列為gtgtaga；
10、發(fā)夾h2的核苷酸序列為gaggacagtggcgctcmgmggccttttggcmcmcgagcgccactgtcctctctacacdt；
11、引物延伸序列p2的核苷酸序列為gtgtagagaggacagtggcgctc；
12、發(fā)夾h3的核苷酸序列為fam-atctcttattgggcctttttggcccaataagagat?-(bhq1)-ccactgtcctctctacac。
13、在本專利技術(shù)的一些實施例中，當(dāng)待測靶標(biāo)mirna為mirna-21或/和mirna-375時，其對應(yīng)的crrna分別為gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacucaaca?ucagucugauaagcuau或/和gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaa?cucacgcgagccgaacgaacaa?a。
14、在本專利技術(shù)的一些實施例中，檢測方法包括如下步驟：首先將含有待測靶標(biāo)mirna的樣品與crispr/cas13a蛋白體系和dna聚合酶驅(qū)動的引物交換反應(yīng)體系混合后第一次孵育，反應(yīng)結(jié)束后滅活dna聚合酶活性；然后加入到核酸外切酶反應(yīng)體系中第二次孵育，反應(yīng)結(jié)束后滅活核酸外切酶活性；最后檢測熒光值。
15、在本專利技術(shù)的一些實施例中，所述熒光生物傳感器的反應(yīng)體系中各組分的終濃度為：每20μl反應(yīng)體系包含cas13a蛋白35?nm、crrna?25?nm、發(fā)夾h1?200?nm、發(fā)夾h2?100?nm、dntp?10?mm、bst3.0?dna聚合酶16?u/20μl，發(fā)夾h3?200?nm，核酸外切酶iii?1?u/μl。
16、在本專利技術(shù)的一些實施例中，第一次孵育的反應(yīng)條件為37℃孵育2?h，滅活dna聚合酶活性的反應(yīng)條件為80℃滅活5?min。
17、在本專利技術(shù)的一些實施例中，第二次孵育的反應(yīng)條件為在37℃下反應(yīng)40?min，滅活核酸外切酶活性的反應(yīng)條件為70℃下加熱20?min。
18、在本專利技術(shù)的一些實施例中，檢測檢測熒光值時參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長為480?nm，發(fā)射波長為500~600nm，激發(fā)峰和發(fā)射峰的狹縫均為5?nm。
19、本專利技術(shù)的有益效果在于：充分利用了cas13a、dna聚合酶和核酸外切酶三種生物酶的特性，對低豐度的外泌體mirnas靶標(biāo)進行了多重放大，實現(xiàn)了多重標(biāo)志物的超靈敏和特異性檢測，為疾病的早期診斷和預(yù)后評估提供了一種全新的參考方法。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護點】
1.一種多酶輔助的用于邏輯檢測外泌體miRNAs的熒光生物傳感器，其特征在于，所述熒光生物傳感器包括CRISPR/Cas13a蛋白體系、DNA聚合酶驅(qū)動的引物交換反應(yīng)體系和核酸外切酶反應(yīng)體系；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，當(dāng)待測靶標(biāo)miRNA為miRNA-21或/和miRNA-375時，其對應(yīng)的crRNA分別為GAUUUAGAC?UACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUAU或/和GAU?UUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCACGCGAGCCGAACGAACAA?A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，檢測方法包括如下步驟：首先將含有待測靶標(biāo)miRNA的樣品與CRISPR/Cas13a蛋白體系和DNA聚合酶驅(qū)動的引物交換反應(yīng)體系混合后第一次孵育，反應(yīng)結(jié)束后滅活DNA聚合酶活性；然后加入到核酸外切酶反應(yīng)體系中第二次孵育，反應(yīng)結(jié)束后滅活核酸外切酶活性；最后檢測熒光值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光生物傳感器，其特征在于，
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光生物傳感器，其特征在于，第一次孵育的反應(yīng)條件為37℃孵育2?h，滅活DNA聚合酶活性的反應(yīng)條件為80℃滅活5?min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光生物傳感器，其特征在于，第二次孵育的反應(yīng)條件為在37℃下反應(yīng)40?min，滅活核酸外切酶活性的反應(yīng)條件為70℃下加熱20?min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光生物傳感器，其特征在于，檢測檢測熒光值時參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長為480?nm，發(fā)射波長為500~600nm，激發(fā)峰和發(fā)射峰的狹縫均為5?nm。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種多酶輔助的用于邏輯檢測外泌體mirnas的熒光生物傳感器，其特征在于，所述熒光生物傳感器包括crispr/cas13a蛋白體系、dna聚合酶驅(qū)動的引物交換反應(yīng)體系和核酸外切酶反應(yīng)體系；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，當(dāng)待測靶標(biāo)mirna為mirna-21或/和mirna-375時，其對應(yīng)的crrna分別為gauuuagac?uaccccaaaaacgaaggggacuaaaacucaacaucagucugauaagcuau或/和gau?uuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacucacgcgagccgaacgaacaa?a。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，檢測方法包括如下步驟：首先將含有待測靶標(biāo)mirna的樣品與crispr/cas13a蛋白體系和dna聚合酶驅(qū)動的引物交換反應(yīng)體系混合后第一次孵育，反應(yīng)結(jié)束后滅活dna聚合酶活性；然后加入到核酸外切酶反應(yīng)體系中第二次孵育，反應(yīng)結(jié)束...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：唱凱，謝作維，陳鳴，鄧瑞佳，盛靜，牛犇，馮柳，龔美琳，楊泓釗，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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