【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及病毒疫苗載體設計領域，特別涉及一種基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法及應用。
技術介紹
1、目前，兩種主要類型的rna被用作預防疾病的疫苗:一種是自我擴增的rna(self-amplifying?rna?sarna)，另一種是非復制的mrna(non-replicating?mrna?nrrna)。sarna疫苗就是一種基于rna復制子的新型疫苗,其含有的rna復制子是衍生于rna病毒基因組并能自主復制的rna，從而實現mrna在細胞質內快速和大量的自我復制。最常用于開發復制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(alphavirus),如辛德比斯病毒(sindbis?virus,sin)、塞姆利基森林病毒(semliki?forest?virus,sfv)等。
2、sfv復制子疫苗主要來源于塞姆利基森林病毒的雙順反子基因組。對于疫苗工程，sfv基因組rna中編碼非結構蛋白的基因被保留，而亞基因組啟動子控制下的結構蛋白基因被感興趣的疫苗抗原取代。非結構蛋白自催化成熟并組裝成多酶復制酶復合物，該復合物能夠復制自己的模板rna。復制酶作為rna依賴性rna聚合酶，順式擴增rna，導致接種宿主細胞中的高載體拷貝數，從而導致疫苗抗原水平高。因此，較低劑量水平的sarna比nrrna可能足以誘導類似的免疫反應。
3、最新研究表明，復制酶也能夠擴增反式rna，復制酶和抗原可以被分裂成兩個rna中，其中感興趣的基因由缺乏復制酶的rna表達，通過非復制mrna反式表達，復制酶與攜帶外源基因的rna相
4、這類疫苗生成的一個有前途的平臺。sarna疫苗不僅編碼抗原基因，還編碼rna復制所需的基因，包括rna依賴性rna聚合酶。通常，sa?rna是一種病毒基因組，缺乏部分或全部病毒結構基因。由于缺乏病毒結構基因，不會發生感染性病毒顆粒的組裝。同時，保留了復制病毒rna所必需的基因，這些部分病毒rna可以在細胞中復制。由于這種自我復制能力，reprna本身可以發揮佐劑的作用，并可以引發強大的免疫反應。在小鼠、非人靈長類動物和人類等幾種動物物種中，自擴增rna作為候選疫苗是有效的。此外，據報道，即使有1/64千在rna的使用量中，sarna疫苗可以達到與合成mrna疫苗相同的保護程度。reprna疫苗以小劑量產生強大免疫力的能力使其成為可以降低制造成本并迅速結束covid-19大流行的候選疫苗。
5、傳統滅活或減毒疫苗需要較長的開發周期，而傳統核酸疫苗抗原表達效率低，均難以滿足需求。由于病毒復制酶的存在，基于病毒復制子的自擴增rna(sarna)疫苗不僅能縮短開發周期，且能夠高水平表達疫苗抗原。因此，基于病毒復制子的sarna疫苗有望打破疫苗開發的瓶頸。
6、目前，基于sfv復制子開發的rna疫苗系統研究還不夠深入，而tarna疫苗系統研究甚少。許多抗原蛋白分子量較大，如ibvs蛋白，pedv?s蛋白，在一般載體中表達效率很低，甚至不能被表達。因此，本專利技術希望提出一種利用sfv復制子能夠通過復制酶增加宿主細胞中高載體拷貝數和mrna安全、高效、能誘導保護性免疫的特點開發基于sfv復制子的sarna與tarna疫苗系統，這種疫苗有望根據快速進化或新出現的病毒病原體的需要，快速和經濟高效地生產大量疫苗。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提出一種基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法及應用，旨在通過在sarna或者tarna系統中插入如禽傳染性支氣管炎病毒s蛋白、新城疫hn基因等，體外轉錄為mrna后兩種系統都能高效表達插入的抗原蛋白，且具有較高的安全性，可應用于研制禽類相關疫苗。
2、第一方面，本專利技術提出一種基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，所述方法包括：
3、(1)以psfvcs-cmv-egfp為材料，構建表達報告基因的sarna系統psfv-cmv-t7-egfp；
4、(2)將psfv-cmv-t7-egfp進行拆分和優化，構建得到tarna系統中復制酶提供質粒psfv-cmv-t7-replicase；
5、(3)將psfv-cmv-t7-egfp進行拆分和優化，構建得到tarna系統中抗原提供質粒psfv-cmv-t7-tr-egfp；
6、(4)將抗原蛋白基因序列x替換報告基因egfp，構建得到psfv-cmv-t7-x或psfv-cmv-t7-tr-x；
7、(5)將psfv-cmv-t7-x、psfv-cmv-t7-tr-x和psfv-cmv-t7-replicase分別線性化后進行體外轉錄制備mrna；
8、(6)將制備的mrna以一定的比例轉染至宿主真核細胞中表達，得到抗原蛋白；
9、(7)收集電轉染后的細胞，得到檢測樣品，并對抗原蛋白檢測，以評估基于sfv復制子的sarna和tarna系統的表達效率。
10、進一步地，步驟(1)中構建的sarna系統包含保留psfvcs-cmv-egfp中的cmv啟動子和增加t7啟動子；
11、步驟(1)中構建的sarna系統包含刪除sfv結構蛋白ce3部分；
12、步驟(1)的構建方式通過同源重組將psfvcs-cmv-egfp分段pcr，構建了表達egfp的sarna系統psfv-cmv-t7-egfp；
13、具體通過引物a1-nsp1-f和a2-nsp4-r從序列如seq?id?no.1所示擴增片段a1；使用限制性核酸內切酶bamh?i和xba?i酶切出載體片段a2；通過同源重組酶將片段a1和片段a2進行同源重組連接，得到表達egfp的sarna系統psfv-cmv-t7-egfp；
14、所述t7啟動子的序列如seq?id?no.1所示；a1-nsp1-f的序列如seq?id?no.6所示；a2-nsp4-r的序列如seq?id?no.7所示。
15、進一步地，步驟(2)中的sfv復制酶的序列如seq?id?no.2所示；
16、步驟(2)中的優化包括5’utr和3’utr的優化；
17、步驟(2)中的優化包括對ploy?a尾進行了延長；
18、步驟(2)中的優化包括線性化酶切位點更改，且質粒上同樣的酶切位點進行了同義突變；
19、步驟(2)中的構建方式通過同源重組將sfv復制酶構建到重組載體a中。
20、進一步地，所述5’utr優化序列選自人α-珠蛋白5’utr，其序列如seq?本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(1)中構建的saRNA系統包含保留pSFVCs-CMV-EGFP中的CMV啟動子和增加T7啟動子；
3.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(2)中的SFV復制酶的序列如SEQ?ID?NO.2所示；
4.根據權利要求3所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，所述5’UTR優化序列選自人α-珠蛋白5’UTR，其序列如SEQ?ID?NO.3所示：
5.根據權利要求4所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(2)中的同源重組的步驟具體如下：通過引物5’UTR-F和B1-BsaI-mut-R從pSFVCs-CMV-EGFP中擴增片段B1；通過引物B2-BsaI-mut-F和B2-BsaI-mut-R從pSFVCs-CMV-EGFP中擴增載體片段B2
6.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(3)中的優化為保留部分SFV復制子序列，包括SFV復制子的nsp1?5’端221bp和nsp4?3’端984bp，其余復制酶部分刪去。
7.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(4)中的構建方式為通過同源重組將含有抗原蛋白的DNA序列構建至表達外源基因的載體；
8.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(2)中采用Spe?I酶切使所述pSFV-CMV-T7-X和pSFV-CMV-T7-TR-X質粒線性化，采用Bsa?I酶切使所述pSFV-CMV-T7-replicase質粒線性化；
9.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(6)中的宿主真核細胞為人腎上皮細胞293T、敘利亞地鼠腎細胞BHK中的至少一種；
10.一種如權利要求1-9任一項所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法得到的taRNA系統或taRNA系統在制備用于哺乳動物的疫苗中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(1)中構建的sarna系統包含保留psfvcs-cmv-egfp中的cmv啟動子和增加t7啟動子；
3.根據權利要求1所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(2)中的sfv復制酶的序列如seq?id?no.2所示；
4.根據權利要求3所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，所述5’utr優化序列選自人α-珠蛋白5’utr，其序列如seq?id?no.3所示：
5.根據權利要求4所述的基于塞姆利基森林病毒復制子的高效表達系統的構建方法，其特征在于，步驟(2)中的同源重組的步驟具體如下：通過引物5’utr-f和b1-bsai-mut-r從psfvcs-cmv-egfp中擴增片段b1；通過引物b2-bsai-mut-f和b2-bsai-mut-r從psfvcs-cmv-egfp中擴增載體片段b2；通過引物b3-bsai-mut2-f和b3-bsai-mut-r從psfvcs-cmv-egfp中擴增片段b3；通過hind?iii和xho?i雙酶切，將3’utr優化序列和優化的polya尾序列從序列如seq?id?no.3所示酶切出片段b4；通過引物a5-f和b5-bsai-mut3-r從psfvcs-cmv-egfp中擴增片段b5；通過引物...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉定祥，李星星，何佳文，陳瑞愛，
申請(專利權)人：嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。