【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，特別涉及反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr、其編碼基因及應用。
技術介紹
1、烏頭酸(aconitic?acid，c6h6o6)，別名丙烯-1,2,3-三羧酸，最早發現于烏頭屬植物aconitum?napellus中，是一種低分子量的有機三羧酸，存在順反異構體，即順式烏頭酸(cis-aconitic?acid，簡稱caa)和反式烏頭酸(trans-aconitic?acid，簡稱taa)。其中，caa是三羧酸循環中順烏頭酸酶催化檸檬酸異構化生成異檸檬酸的中間產物，而taa對順烏頭酸酶具有一定的抑制作用，順烏頭酸酶作為三羧酸循環中的關鍵酶，抑制順烏頭酸酶活性可以干擾三羧酸循環，從而影響生命活動，在生物農藥領域展現出良好的應用前景。多項研究表明taa在線蟲防治等方面具有較好的效果，可抑制或殺死甘薯莖線蟲、大豆孢囊線蟲和南方根結線蟲，另外，有研究表明taa可抑制利什曼原蟲的生長、使褐飛虱拒食，還具有抗水腫和抗炎癥等功效。
2、taa主要由植物和微生物分泌，taa是根際環境中廣泛分布的植物碳源。根際微生物對于植物根系分泌物尤其是碳源的同化利用能力對其生長、定殖至關重要。因此，積極探索微生物同化利用新型碳源taa的作用機制，在基因組水平上開展taa同化利用相關基因的挖掘、篩選，并對關鍵調控基因進行功能解析，不僅可為微生物碳源營養利用機制提供研究基礎，而且為通過基因工程技術等定向遺傳操作技術，將taa同化利用相關基因表達于益生菌中以創制高效合成和利用taa的微生物品種提供了重要的基因資源與技術支撐，對于提高益生
3、然而，目前有關微生物同化利用taa相關基因的研究鮮有報道，缺乏可有效利用的基因資源。因此亟需開發和尋找新型的taa碳源代謝調控相關基因。
技術實現思路
1、針對現有技術中的上述技術問題，本專利技術提供了一種taa響應性轉錄因子tarr及其編碼基因，轉錄因子tarr與taa直接結合被激活，隨后通過與taa同化利用操縱子的啟動子區域結合，促進taa同化利用操縱子中相關基因的轉錄翻譯，進而有利于微生物細胞同化利用taa，在微生物taa的高效合成與利用中具有良好的應用價值，為利用基因工程手段提高taa利用效率、增強微生物碳源利用能力提供了優良的基因基因資源和新的策略。而且，本專利技術的轉錄因子可與taa特異性結合，在taa親和純化領域具有良好的應用潛力。由此本專利技術提供了taa響應性轉錄因子tarr或其編碼基因在調控反式烏頭酸同化利用操縱子表達和調控微生物反式烏頭酸利用能力以及在反式烏頭酸親和純化等中的應用。本專利技術具體通過以下方案實現：
2、本專利技術第一方面提供了一種反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr，氨基酸序列如seqid?no.2所示。
3、本專利技術第二方面提供了一種反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr編碼基因，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、本專利技術第三方面提供了如上所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，所述反式烏頭酸同化利用操縱子包括啟動子，所述轉錄因子通過與所述啟動子結合來發揮對反式烏頭酸同化利用操縱子轉錄的促進作用，所述啟動子的核苷酸序列如seq?id?no.3第862-1034堿基所示。
5、進一步地，所述反式烏頭酸同化利用操縱子還包括tara基因和tarb基因，所述tara基因的核苷酸序列如seq?id?no.3第1035-2165堿基所示，所述tarb基因的核苷酸序列如seq?id?no.3第2209-3585堿基所示。
6、進一步地，調控所述反式烏頭酸同化利用操縱子的表達包括正向調控和負向調控，其中，通過增強所述轉錄因子tarr的表達量，促進所述烏頭酸同化利用操縱子的表達；通過降低所述轉錄因子tarr的表達量，抑制所述烏頭酸同化利用操縱子的表達。
7、進一步地，促進所述烏頭酸同化利用操縱子的表達包括以下步驟：構建轉錄因子tarr表達載體，轉化野生型微生物，培養獲得tarr編碼基因表達的轉基因微生物。
8、更進一步地，構建轉錄因子tarr表達載體包括以下步驟：以貝萊斯芽胞桿菌fzb42基因組為模板，利用amye-uf/amye-ur引物對、ctarr-f/ctarr-r引物對和amye-df/amye-dr引物對分別進行pcr擴增得到amye-up、tarr和amye-down片段；以卡那霉素抗性基因為模板，利用kan-f/kan-r引物對擴增得到kan片段；其中，amye-uf/amye-ur引物對的核苷選序列如seq?id?no.20-21所示，ctarr-f/ctarr-r引物對的核苷選序列如seq?id?no.22-23所示，kan-f/kan-r引物對的核苷酸序列如seq?id?no.24-25所示，amye-df/amye-dr引物對的核苷酸序列如seq?id?no.26-27所示；通過重疊延伸pcr將amye-up、tarr、kan、amye-down片段依次連接，得到融合后的目的片段，將所述目的片段通過ta克隆技術連接到t載體上，得到所述轉錄因子tarr表達載體。
9、進一步地，抑制所述烏頭酸同化利用操縱子的表達包括以下步驟：構建轉錄因子tarr敲除載體，轉化野生型微生物，培養獲得tarr編碼基因缺失的轉基因微生物。
10、更進一步地，構建轉錄因子tarr敲除載體包括以下步驟：以貝萊斯芽胞桿菌fzb42基因組為模板，利用tarr-uf/tarr-ur引物對和tarr-df/tarr-dr引物對分別進行pcr擴增得到tarr-up和tarr-down片段；以氯霉素抗性基因為模板，利用cm-f/cm-r引物對進行pcr擴增得到cm基因片段；其中，tarr-uf/tarr-ur引物對的核苷選序列如seq?id?no.4-5所示，tarr-df/tarr-dr引物對的核苷選序列如seq?id?no.8-9所示，cm-f/cm-r引物對的核苷酸序列如seq?id?no.6-7所示；通過重疊延伸pcr將tarr-up、cm和tarr-down片段依次連接，得到融合后的目的片段，將所述目的片段通過ta克隆技術連接到t載體上，得到所述轉錄因子tarr敲除載體。
11、進一步地，所述微生物為細菌；更進一步地，為貝萊斯芽胞桿菌。
12、本專利技術第四方面提供了如上所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸利用能力中的應用。
13、本專利技術第五方面提供了如上所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr或其編碼基因在反式烏頭酸親和純化中應用。本專利技術的優點及積極效果為：
14、1、本專利技術提供的轉錄因子tarr與taa直接結合被激活，隨后通過與taa同化利用操縱子的啟動子區域結合，促進taa同化利用操縱子中ta本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.一種反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR編碼基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID?NO.1所示。
3.如權利要求1所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，其特征在于，所述反式烏頭酸同化利用操縱子包括啟動子，所述轉錄因子通過與所述啟動子結合來發揮對反式烏頭酸同化利用操縱子轉錄的促進作用，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3第862-1034堿基所示。
4.根據權利要求3所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，其特征在于，所述反式烏頭酸同化利用操縱子還包括tarA基因和tarB基因，所述tarA基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3第1035-2165堿基所示，所述tarB基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3第2209-3585堿基所示。
5.根據權利要求3所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編
6.根據權利要求5所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，其特征在于，促進所述烏頭酸同化利用操縱子的表達包括以下步驟：
7.根據權利要求5所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，其特征在于，抑制所述烏頭酸同化利用操縱子的表達包括以下步驟：
8.根據權利要求3所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，其特征在于，所述微生物為貝萊斯芽胞桿菌。
9.如權利要求1所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸利用能力中的應用。
10.如權利要求1所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子TarR或其編碼基因在反式烏頭酸親和純化中應用。
...【技術特征摘要】
1.一種反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr，其特征在于，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
2.一種反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr編碼基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqid?no.1所示。
3.如權利要求1所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，其特征在于，所述反式烏頭酸同化利用操縱子包括啟動子，所述轉錄因子通過與所述啟動子結合來發揮對反式烏頭酸同化利用操縱子轉錄的促進作用，所述啟動子的核苷酸序列如seq?id?no.3第862-1034堿基所示。
4.根據權利要求3所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操縱子表達中的應用，其特征在于，所述反式烏頭酸同化利用操縱子還包括tara基因和tarb基因，所述tara基因的核苷酸序列如seq?id?no.3第1035-2165堿基所示，所述tarb基因的核苷酸序列如seq?id?no.3第2209-3585堿基所示。
5.根據權利要求3所述的反式烏頭酸響應性轉錄因子tarr或其編碼基因在調控微生物反式烏頭酸同化利用操...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭操，都萃穎，耿策，楊承儒，孫博文，林子蒙，董心怡，胡思宇，汪詩旋，
申請(專利權)人：湖北工程學院，
類型：發明
國別省市：
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