【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及中藥分析，具體為一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用。
技術介紹
1、黨參，是臨床上最受歡迎的傳統草藥之一，具有健脾、補肺、養血、生津的功效。現代醫學研究表明，黨參可用于脾虛證，冠心病、胃潰瘍、調節免疫功能、延緩衰老和提高學習能力。黨參化學成分是黨參品質形成的物質基礎。研究表明，黨參化學成分不僅與黨參的類型、產地氣候、等級和部位密切相關。雖然黨參含有生物堿、炔烴、萜類、黃酮類和糖類等多種化學成分，但是《中國藥典》中沒有關于質量評價的指標物質。因此黨參藥效物質研究開始被關注。在獲得黨參化學成分信息的基礎上，進一步研究黨參根中化學成分的空間分布，對于理解黨參農業生產中化學成分的遷移和合成，以及黨參進行系統分離及其組成給藥配方的精準設計都具有重要意義。
2、高空間分辨率的圖像為了解物質的生物合成途徑提供了重要線索，通過空間代謝組學可以充分了解藥效物質在生長發育和非生物脅迫下的合成和調控機制。因此，研究黨參根中入血藥效物質的空間分布信息，可以對其發揮作用的活性成分進行可視化分析，與黨參活性物質提取分離，完善藥典的質量控制，及其代謝通路與機制研究密切相關。
3、采用超高效液相高分辨質譜對黨參治療疾病后進入體內的入血成分進行分析，依據入血成分二級質譜圖準分子離子及特征碎片離子，鑒定入血成分。這些化合物均可能是黨參在體內產生藥效作用的物質。
4、但是整個過程缺少對入血成分在植物分布中空間維度的信息，缺乏對物質的進入機體后或植物的組織分布與定位及相對含量測定。
5、未對入血成
技術實現思路
1、本專利技術為解決上述問題，本專利技術要提供一種黨參根中入血藥效物質的質譜成像方法及其應用。對黨參給藥后的入血入組織成分進行其黨參根部的精準定位與含量測定分析，揭示顯效成分在黨參根中的具體分布，完善黨參化學成分給藥機制的探究，可以對其發揮作用的活性成分進行可視化分析，與黨參活性物質提取分離，完善藥典的質量控制，及其代謝通路與機制研究密切相關。使黨參發揮作用的合成路徑及分布位置最大程度的被人們所了解，給臨床治療提供經驗。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用，其方法包括以下步驟：
3、s1、黨參治療疾病的藥效學研究及血清藥物化學分析
4、(1)動物模型的建立：以脾虛模型為例
5、實驗動物保持在溫度20℃左右，相對濕度50±5％的環境中飼養，定時通風，空間充足，不限制基礎飼糧與飲水，在實驗開始前適應性飼養7天。72只大鼠隨機分為正常對照組(control)12只、模型對照組(model)12只、黨參(cp-l)低劑量組12只、黨參中劑量組(cp-m)12只、黨參高劑量組(cp-h)12只和四君子湯陽性組(sjzt)12只。
6、(2)血清藥物化學分析：樣品處理
7、取黨參醇提物樣品150μl，于1.5ml?ep管中，真空干燥；加入300μl40％甲醇水溶液復溶；渦旋混勻30s；離心15min(16000g,4℃)，取上清液，即得。
8、取血清樣品適量，加入甲醇，渦旋混合60s，-20℃靜置30min，16000g4℃離心20min，取上清真空干燥，殘渣加入40％甲醇水溶液100μl，渦旋，16000g?4℃離心15min，取上清液，即得。
9、取血清樣品適量，加codonopsis?pilosula提取液，加入甲醇，渦旋混合60s，20℃靜置30min，16000g?4℃離心20min，取上清真空干燥，殘渣加入100μl?40％甲醇水溶液，渦旋，16000g?4℃離心15min，取上清液，即得。
10、(3)色譜質譜分析
11、樣品采用vanquish?uhplc(thermo?scientific,waltham,ma)超高效液相色譜系統結合acquity?uplc?hss?t3(2.1mm?x?100mm,1.8μm)色譜柱進行分離；柱溫35℃；流速0.3ml/min；流動相組成a?0.1％甲酸水溶液，b?0.1％.甲酸乙腈溶液；按下表進行梯度洗脫。
12、表1-梯度洗脫程序表
13、
14、采用q-exactive?hfx質譜儀進行樣本一級、二級譜圖的采集。q-exactive?hfx質譜儀樣品與uhplc系統聯用，電噴霧電離(esi)正、負兩種離子模式分別進行質譜采集。噴霧電壓3800v(esi+)/3500v(esi-)，鞘氣壓力45arb，輔助氣壓力20arb，離子傳輸管溫度320℃，霧化溫度350℃；檢測方式為全掃描/數據依賴二級掃描(full-ms/dd-ms2)模式，一級和二級分辨率分別為60000和15000，top?10ms1離子獲得ms/ms譜圖，碰撞能量(ces)采用階梯歸一化能級20、40、60；一級質荷比掃描范圍90～1300。
15、(4)血清樣品檢測分析
16、分別精密吸取空白組樣品、給藥組樣品、空白組+codonopsis?pilosula樣品各6μl，以及codonopsis?pilosula溶液2μl，lc-ms進樣分析，每批空白組樣品、給藥組樣品各進樣1次，空白組+codonopsis?pilosula樣品重復進樣3次，codonopsis?pilosula樣品重復進樣5次。
17、(5)數據處理
18、將格式為.raw的原始數據文件導入proteowizard轉換成.mzxml格式，采用xcms軟件進行峰對齊、保留時間校正和峰提取，通過數據庫進行化合物鑒定，一級質量誤差小于25ppm，二級碎裂譜圖匹配度score大于0.7，其中得分越高，譜圖相似度越高，目前一般普遍認為0.7以上，鑒定結果可靠；
19、s2、入血成分在中藥中的分布研究
20、將新鮮的黨參根洗凈并將主根支根分離置于-80℃冰箱直至用于切片檢測。
21、打開thermo?cryostarnx50冷凍切片機，使冷凍室溫度降至-10℃；將組織從-80℃冰箱中取出，放入冷凍室平衡3小時；用包埋液將樣品固定在可定位樣品頭上，調整樣品的角度和方位，按切片機使用說明進行切片；質譜成像所用切片厚度為14μm；將切片用預冷的毛刷轉移至預冷的ito導電載玻片上，干燥20min；若切片樣本不立即檢測，將ito導電載玻片置于-80℃保存。
22、在切好組織的ito玻片上標記樣本信息后，打開循環噴霧基質噴涂裝置(suncollect,sunchrom)進行基質噴涂，基質噴涂信息如下表(如果是從-80℃保存冰箱中取出的ito組織切片，需要進行干燥20min后，再進行基質噴涂)，噴嘴溫度為室溫，噴涂速度1000mm/min，每層噴涂的流速呈梯度變化，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用，其特征在于：其方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用，其特征在于：步驟S1中，所述空白組大鼠每天上午7時灌胃生理鹽水2mL，下午7時腹腔注射生理鹽水0.5mg/kg，模型組大鼠每日上午7時灌胃生理鹽水2mL，下午7時腹腔注射利血平0.5mg/kg，黨參組每天早上7時灌胃黨參醇提物，低劑量灌胃2g/kg，中劑量灌胃4g/kg，高劑量灌胃8g/kg，下午7時腹腔注射利血平0.5mg/kg，四君子湯陽性組每天上午7時灌胃四君子湯20g/kg，下午7時腹腔注射利血平0.5mg/kg，連續14天。
3.根據權利要求1所述的一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用，其特征在于：步驟S2中，所述在對代謝組學數據進行多元統計分析之前，需要將數據進行適當的權重轉換，即標準化(Scaling)處理，目前代謝組學研究常用的數據標準化方式有中心化處理、自適換算與帕萊托換算，本分析對數據采用自適換算，以獲得更加可靠且更加直觀的結果。
4.根據權利要求1所述的一種黨參根
...【技術特征摘要】
1.一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用，其特征在于：其方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用，其特征在于：步驟s1中，所述空白組大鼠每天上午7時灌胃生理鹽水2ml，下午7時腹腔注射生理鹽水0.5mg/kg，模型組大鼠每日上午7時灌胃生理鹽水2ml，下午7時腹腔注射利血平0.5mg/kg，黨參組每天早上7時灌胃黨參醇提物，低劑量灌胃2g/kg，中劑量灌胃4g/kg，高劑量灌胃8g/kg，下午7時腹腔注射利血平0.5mg/kg，四君子湯陽性組每天上午7時灌胃四君子湯20g/kg，下午7時腹腔注射利血平0.5mg/kg，連續14天。
3.根據權利要求1所述的一種黨參根中藥入血藥效物質質譜成像方法和應用，其特征在于：步驟s2中，所述在對代謝組學數據進行多元統計分析之前，需要將數據進行適當的權重轉換，即標準化(scalin...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許晉芳，吳昕潔，李彤彤，童通，何惠，盧曉林，
申請(專利權)人：山西醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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