【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因檢測領域，具體涉及一種基于crispr/cas12a的egfr基因突變檢測體系和方法。
技術介紹
1、表皮生長因子受體(epidermal?growth?factor?receptor,?egfr)是一種跨膜糖蛋白，具有胞內酪氨酸激酶(tk)活性，控制細胞增殖和血管生成。egfr屬于致癌基因，在多種人類惡性腫瘤中被檢測到，包括非小細胞肺癌(nsclc)、頭頸癌、乳腺癌、卵巢癌和結腸癌等。nsclc在目前發病率和致死率的肺癌中，其發生占比高達85%。而在nsclc所有發生的egfr突變中，該基因的19號外顯子的缺失和21號外顯子的l858r點突變分別占了47%和41%。這些突變導致nsclc對酪氨酸激酶抑制劑(tkis)的藥物具有敏感性，可作為tkis藥物的用藥指導位點。
2、現階段對dna樣本egfr基因19號外顯子缺失和21號外顯子l858r點突變的檢測，主要有熒光定量pcr或二代測序等方式。然而，對于少量且明確的egfr基因突變位點檢測，使用二代測序的方法檢測存在周期長、成本高和設備復雜等問題，因此在針對性檢測egfr基因19號外顯子缺失和21號外顯子l858r點突變這2個位點時，熒光定量pcr成為市面上更常用的方法(cn?118240940?a)。而熒光定量pcr體系檢測egfr突變時仍存在以下幾點不足：1)對于點突變位點的檢測，在開發過程中需花費較多成本進行引物和探針序列結構修飾和blocker篩選優化以提高檢測靈敏度和特異性；2)?對dna純度有一定要求，需選用合適的石蠟樣本提取試劑盒，且
3、作為“下一代分子診斷”的crispr/cas技術，具有快速、便攜、成本低廉、靈敏度高、特異性強等優點，已被證明可用于snp分型、腫瘤基因突變檢測等多種用途。如以張峰團隊發現的ⅱ型cas12a為例，在crrna引導下cas12a蛋白可特異性識別并切割靶基因，隨后激活cas12a的反式切割活性。基于該原理，cn116377036a提供了一種基于crispr/cas12a的肺癌患者外周血egfr基因突變檢測系統和方法，將帶有熒光報告基團的ssdna片段作為cas12a蛋白的反式切割對象，通過熒光信號的釋放提示靶基因存在，從而鑒定樣本中是否含有待測靶基因。但該方法在對樣本進行rpa擴增后，對擴增產物進行熒光檢測時需使用熒光檢測裝置用于熒光激發并檢測，對檢測設備條件有要求，不適用于快速便捷的檢測；或通過藍光照射進行裸眼可視化觀察，對結果判斷不夠客觀，在較低熒光強度下難以判別。此外，該方法所處理的樣本為人工合成的含有egfr突變基因的質粒dna，背景干擾較少。然而在實際應用樣本層面，由于血漿樣本中的ctdna高度碎片化且通常以低豐度水平存在，現在的技術難以使用血液提取的dna樣本可靠地檢測egfr突變，因此目前主要使用被保存的石蠟包埋患者腫瘤組織樣本進行dna提取，從而進行egfr突變檢測。因此，有必要開發一種可適用于石蠟包埋組織的快速、便捷的egfr突變檢測體系和方法。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中基于crispr/cas12a的egfr基因突變檢測方法存在的對樣本要求較高、需要實驗室檢測設備等問題，本專利技術提供了一種可適用于石蠟包埋組織樣本的基于crispr/cas12a的egfr基因突變檢測體系和方法，該方法無需熒光檢測設備，并在相似的時間下，僅需crispr側向層析檢測試紙條即可快速、便捷地對檢測結果進行報告，且對石蠟包埋組織樣本的突變頻率檢測下限可達到0.5%~1%。
2、本專利技術采用的技術方案是：一種基于crispr/cas12a的egfr基因突變檢測體系，包括rpa系統、報告系統；所述rpa系統包括針對egfr突變位點野生型序列的限制性核酸內切酶或其編碼基因、針對egfr突變位點的rpa引物或其編碼基因、rpa試劑；所述報告系統包括針對egfr突變位點的crrna、cas蛋白或其編碼基因、單鏈報告dna；其中，所述單鏈報告dna標記有熒光報告分子或crispr側向層析檢測試紙條報告分子。
3、為提供一種方便快捷、可適用于石蠟包埋組織樣本的基于crispr/cas12a的egfr基因突變檢測體系和方法，本專利技術開發了一種可利用crispr側向層析檢測試紙條對egfr基因突變檢測結果進行報告的檢測體系和方法。不同于熒光信號檢測，crispr側向層析檢測試紙條無需熒光檢測設備，且對檢測線/質控線的判讀較裸眼觀察更為客觀。進一步地，為滿足crispr側向層析檢測試紙條對報告分子的濃度要求，克服從石蠟包埋組織樣本提取核酸后dna有所降解且含較多抑制性物質的問題，本專利技術在檢測體系以及檢測方法上，都進行了創造性地改進，以提高檢測特異性。
4、在檢測體系上，為排除組織樣本中大量野生型序列對檢測結果造成背景干擾，本專利技術在rpa系統中添加了適量的針對egfr突變位點野生型序列的限制性核酸內切酶，用于特異性地識別并切割rpa擴增得到的野生型增序列，聯合crispr/cas12a檢測中具有特異性識別能力的crrna序列，剩余未被酶切的野生型片段不會引起非特異陽性檢測信號，從而可以保證適量dna投入下檢測結果的特異性。需要說明的是，所述的rpa系統中無需添加限制性核酸內切酶緩沖液。實驗結果表明，加入限制性核酸內切酶緩沖液后可能對擴增有一定抑制，導致實驗結果異常。
5、在檢測方法上，為在更短的檢測時間下提高檢測特異性，本專利技術通過設置cas12a/crrna的復合體孵育步驟以提高cas12a/crrna復合體的反式切割活性，而非對rpa反應產物進行純化后再進行crispr/cas12a反式剪切反應。一般情況下，對rpa反應產物進行純化需要耗時60~90?min，這一步無法滿足快速檢測的要求。而cas12a/crrna的復合體孵育步驟僅耗時20~40?min，可與伴隨限制性核酸內切酶的rpa反應(耗時約30~40?min)同時進行，從而優化了實驗流程，節約了檢測時間，也相較熒光報告的方式(cn116377036a)無需額外延長檢測時間。
6、作為優選，所述egfr突變位點包括l858r和/或e19缺失突變；所述e19缺失突變包括e19-e746_a750[1][2]、e19-l747_p753>s、e19-l747_t751中的至少一種。在本專利技術的一個具體實施例中，可一次對l858r、e19-e746_a750[1][2]、e19-l747_p753>s、e19-l747_t751四種突變（其中，e19-e746_a750[1][2]存在dna序列上的2種亞型突變，但反應在氨基酸序列上是相同的）進行檢測，且e19-e746_a750[1][2]、e19-l747_p753>s、e19-l747_t751覆蓋了75%~80%的e19缺失突變，而單獨檢測e19-e746_a750則只能覆蓋50%左右的e19缺失突變。可以理解的是，本專利技術提供本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于CRISPR/Cas12a的EGFR基因突變檢測體系，其特征在于，
2.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，包含以下至少任一項：
3.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，包含以下至少任一項：
4.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，
5.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，包含以下至少任一項：
6.一種EGFR基因突變檢測產品，其特征在于，包括如權利要求1~5任一所述的檢測體系。
7.體外非診斷目的利用權利要求6所述的檢測產品基于CRISPR/Cas12a的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，包含以下至少任一項：
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，包含以下至少任一項：
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，
【技術特征摘要】
1.一種基于crispr/cas12a的egfr基因突變檢測體系，其特征在于，
2.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，包含以下至少任一項：
3.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，包含以下至少任一項：
4.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，
5.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，包含以下至少任一項：
6.一種egfr基因突變檢...
【專利技術屬性】
技術研發人員：濮悅，楊帆，李良鑒，
申請(專利權)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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