【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及nk細胞培養，具體涉及一種nk細胞的規模化培養方法及采用的培養基。
技術介紹
1、自然殺傷細胞(natural?killer?cell，nk)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。nk細胞作為機體防御體系的第一道防線，不僅可以在天然免疫系統中發揮其主要的抗腫瘤效應，而且在免疫反應的早期可以分泌不同的細胞因子和各種趨化因子來調節機體獲得性免疫應答，是機體發揮免疫效應不可或缺的效應細胞。近年來，nk細胞因其細胞殺傷活性高、起效快、不受mhc限制等優點，相對于αβt細胞、γδt細胞和cik等其它用于免疫治療的細胞，nk細胞受到了更廣泛的關注和臨床應用。nk細胞對于機體防御和抗腫瘤至關重要，但腫瘤病人體內的nk細胞通常是功能受損的，因此，通過外源輸入功能正常或經過基因改造的功能加強的nk細胞對腫瘤細胞進行殺傷，即nk細胞過繼治療，是目前癌癥治療的前沿和熱點。此外，nk細胞治療對病毒或細菌感染、免疫調節等相關疾病以及抗衰老也有一定的療效。
2、但是nk細胞數量較少，在外周血中僅占淋巴細胞的10％-15％，在臍帶血中nk的含量更低，只有5％左右，正常人體外周血和臍帶血中nk細胞含量遠遠不能滿足臨床治療的需要。在最早開展的臨床試驗中,人們常使用免疫磁珠的方法分離血液中的nk細胞（cd3-/cd56+）,之后利用無血清培養液加自體血漿加il-2或者其它細胞因子,擴增純化的nk細胞。這種方法獲得的nk細胞純度高,但是由于沒有其它免疫細胞的支撐作用
3、因此，如何克服現有技術存在的上述不足，開發出一種新的能夠高效激活擴增nk細胞、無外源血清無自體血清使用、安全有效的人nk細胞的體外規模化培養方法是目前本領域亟需解決的技術問題。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提出一種nk細胞的規模化培養方法及采用的培養基，能夠高效激活擴增nk細胞、無外源血清無自體血清使用、安全有效，能夠較好的促進nk細胞增殖，延長其活力，且安全無副作用，具有廣闊的應用前景。
2、本專利技術的技術方案是這樣實現的：
3、本專利技術提供一種培養基，在actm（全稱為alys505nk-ac，購于珠海貝索生物技術有限公司）培養基中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素、刺激擴增促進磁性微球，攪拌混合均勻，制得培養基。
4、作為本專利技術的進一步改進，所述actm培養基中胎牛血清的含量為7-12wt%，青霉素的含量為80-120u/ml、鏈霉素的含量為80-120u/ml、刺激擴增促進磁性微球100-200μg/ml。
5、作為本專利技術的進一步改進，所述刺激擴增促進磁性微球的制備方法如下：
6、s1.?將氯化鐵、氯化亞鐵和親水乳化劑溶于水中，制得水相；將正硅酸烷基酯、親油乳化劑溶于乙酸乙酯中，制得油相；將水相滴加入油相中，乳化，滴加氨水，加熱攪拌反應，離心，洗滌，干燥，煅燒，制得包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球；
7、s2.?將包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球加入水中，加入單寧酸和催化劑，加熱攪拌反應，磁鐵分離，洗滌，干燥，制得改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球；
8、s3.?將改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球加入水中，加入nhs（n-hydroxysuccinimide，n-羥基丁二酰亞胺）和edc（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺），攪拌活化，加入藻藍蛋白和絲素蛋白肽，攪拌反應，磁鐵分離，洗滌，冷凍干燥，制得蛋白偶聯改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球；
9、s4.?將蛋白偶聯改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球加入水中，加入nhs和edc，攪拌活化，加入細胞復合因子，攪拌反應，磁鐵分離，洗滌，冷凍干燥，制得刺激擴增促進磁性微球。
10、作為本專利技術的進一步改進，步驟s1中所述氯化鐵、氯化亞鐵、親水乳化劑、正硅酸烷基酯、親油乳化劑的質量比為3.24:1.26:0.2-0.5:3-5:0.1-0.2，所述親水乳化劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85中的至少一種；所述親油乳化劑選自司盤-20、司盤-40、司盤-60、司盤-80、司盤-85中的至少一種；所述滴加氨水調節溶液ph值為9-10，所述加熱攪拌反應的溫度為70-80℃，時間為4-7h，所述乳化的轉速為5000-8000r/min，時間為15-25min，所述干燥的溫度為60-70℃，時間為2-4h，所述煅燒的溫度為500-700℃，時間為1-2h。
11、作為本專利技術的進一步改進，步驟s2中所述包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球、單寧酸和催化劑的質量比為10:3-4:0.5-1，所述催化劑的ph值為8.5-9.5的tris-hcl溶液，所述加熱攪拌反應的溫度為40-50℃，時間為3-5h。
12、作為本專利技術的進一步改進，步驟s3中所述改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球、nhs、edc、藻藍蛋白和絲素蛋白肽的質量比為10:2-3:1-3:2-3:4-5，所述攪拌活化的時間為20-30min，所述攪拌反應的時間為10-12h。
13、作為本專利技術的進一步改進，步驟s4中所述蛋白偶聯改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球、nhs、edc和細胞復合因子的質量比為10-12:2-3:1-3:4-5，所述細胞復合因子選自il-2（白細胞介素-2）、il-15（白細胞介素-15）、il-12（白細胞介素-12）、il-18（白細胞介素-18）、il-21（白細胞介素-21）中的至少兩種，優選地，為il-15和il-12，質量比為10：3-7；所述攪拌活化的時間為20-30min，所述攪拌反應的時間為8-10h。
14、本專利技術進一步保護一種nk細胞的規模化培養方法，將nk細胞接種于上述的培養基中，培養，外加磁場攪拌，離心，將nk細胞沉淀用dpbs（dulbecco's?phosphate-bufferedsaline，杜氏磷酸鹽緩沖液）洗滌，重懸，凍存，制得規模化培養的nk細胞。
15、作為本專利技術的進一步改進，所述培養的條件為37℃，5%co2飽和濕度的培養箱中培養7-10d。
16、作為本專利技術的進一步改進，所述接種的密度為3-5×104cell/ml；所述離心的條件為550-600g，時間為5-10min。
17、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種培養基，其特征在于，在ACTM培養基中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素、刺激擴增促進磁性微球，攪拌混合均勻，制得培養基。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述ACTM培養基中胎牛血清的含量為7-12wt%，青霉素的含量為80-120U/mL、鏈霉素的含量為80-120U/mL、刺激擴增促進磁性微球100-200μg/mL。
3.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述刺激擴增促進磁性微球的制備方法如下：
4.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于，步驟S1中所述氯化鐵、氯化亞鐵、親水乳化劑、正硅酸烷基酯、親油乳化劑的質量比為3.24:1.26:0.2-0.5:3-5:0.1-0.2，所述親水乳化劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85中的至少一種；所述親油乳化劑選自司盤-20、司盤-40、司盤-60、司盤-80、司盤-85中的至少一種；所述滴加氨水調節溶液pH值為9-10，所述加熱攪拌反應的溫度為70-80℃，時間為4-7h，所述乳化的轉速為5000-8000r/min，時間為15-25min，所述干
5.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于，步驟S2中所述包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球、單寧酸和催化劑的質量比為10:3-4:0.5-1，所述催化劑的pH值為8.5-9.5的Tris-HCl溶液，所述加熱攪拌反應的溫度為40-50℃，時間為3-5h。
6.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于，步驟S3中所述改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球、NHS、EDC、藻藍蛋白和絲素蛋白肽的質量比為10:2-3:1-3:2-3:4-5，所述攪拌活化的時間為20-30min，所述攪拌反應的時間為10-12h。
7.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于，步驟S4中所述蛋白偶聯改性包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球、NHS、EDC和細胞復合因子的質量比為10-12:2-3:1-3:4-5，所述細胞復合因子為IL-15和IL-12，質量比為10：3-7；所述攪拌活化的時間為20-30min，所述攪拌反應的時間為8-10h。
8.一種NK細胞的規模化培養方法，其特征在于，將NK細胞接種于權利要求1-7任一項所述的培養基中，培養，外加磁場攪拌，離心，將NK細胞沉淀用DPBS洗滌，重懸，凍存，制得規模化培養的NK細胞。
9.根據權利要求8所述的NK細胞的規模化培養方法，其特征在于，所述培養的條件為37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱中培養7-10d，所述外加磁場的磁場強度為0.1-0.15T。
10.根據權利要求8所述的NK細胞的規模化培養方法，其特征在于，所述接種的密度為3-5×104cell/mL；所述離心的條件為550-600g，時間為5-10min。
...【技術特征摘要】
1.一種培養基，其特征在于，在actm培養基中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素、刺激擴增促進磁性微球，攪拌混合均勻，制得培養基。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述actm培養基中胎牛血清的含量為7-12wt%，青霉素的含量為80-120u/ml、鏈霉素的含量為80-120u/ml、刺激擴增促進磁性微球100-200μg/ml。
3.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述刺激擴增促進磁性微球的制備方法如下：
4.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于，步驟s1中所述氯化鐵、氯化亞鐵、親水乳化劑、正硅酸烷基酯、親油乳化劑的質量比為3.24:1.26:0.2-0.5:3-5:0.1-0.2，所述親水乳化劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85中的至少一種；所述親油乳化劑選自司盤-20、司盤-40、司盤-60、司盤-80、司盤-85中的至少一種；所述滴加氨水調節溶液ph值為9-10，所述加熱攪拌反應的溫度為70-80℃，時間為4-7h，所述乳化的轉速為5000-8000r/min，時間為15-25min，所述干燥的溫度為60-70℃，時間為2-4h，所述煅燒的溫度為500-700℃，時間為1-2h。
5.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于，步驟s2中所述包覆磁性四氧化三鐵的二氧化硅球、單寧酸和催化劑的質量比為10:3-4:0.5-1，所述催化劑的ph值...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳昊，竇柏蕊，閆璐，張亞超，馮悅，周云竹，趙越，
申請(專利權)人：吉林國健生命工程科學技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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