【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于干細胞培養，涉及一種將腸神經嵴細胞誘導分化為膠質前體細胞的構建方法及應用。
技術介紹
1、腸道作為人體內最為重要的器官之一，其功能的實現以及與機體其他器官間的相互作用的調節的關鍵之一是腸神經系統。腸神經系統紊亂與很多腸道相關疾病有著密切的關系，如結腸遠端缺乏神經元導致的先天性巨結腸，因此在臨床治療中如何有效恢復和重建腸神經系統非常重要。
2、腸神經系統的發育涉及腸神經從祖細胞向膠質細胞和神經元的分化。而這些分化過程，在胚胎期就決定了?，F有研究和治療腸神經系統尤其是胚胎發育的工具，包括細胞系，干細胞和類器官等。n-2a、sy5y等細胞系容易培養，方便進行體外實驗，但這些細胞系是腫瘤來源的，通常表現出異常的代謝行為，難以運用到細胞治療中。間充質干細胞具有分化潛能，但其臨床應用還存在很多挑戰，如移植存活率低，難以進行體內分化等。腸神經嵴細胞(enteric?neural?crest?cells,enccs)可以自我更新并分化為神經元和膠質細胞來重建神經系統，但enccs移植存在一些瓶頸，包括移植前增殖和遷移不足，短期移植過程中大量凋亡，神經回路重建無效等，用細胞因子、藥物和信號通路調節劑治療enccs以改善這些副作用也未能完全修復腸神經系統功能。目前研究熱點的多能干細胞hesc在倫理上存在爭議，ipsc在倫理上更容易接受，但無論是通過hesc細胞還是ipsc細胞衍生，都存在發生腫瘤的潛在風險。此外使用hesc或ipsc衍生的encc進行同種異體移植還需要終身使用免疫抑制劑，以減少排斥反應和移植物抗宿主病，但這
3、課題組前期通過單測序，發現了一群具有雙向潛能的膠質前體細胞，這群細胞既能分化為神經元，也能分化為膠質細胞，其他研究也表明，膠質前體細胞具有發育為神經元的可能，這表明膠質前體細胞是一種潛在治療腸神經系統疾病的良好工具，它存在于正常的腸道細胞中，且具有分為了神經元的潛能，可以不用進行額外的細胞移植，通過自身誘導分化，即可以分化為神經元，治療先天性巨結腸等腸神經細胞疾病。
4、既往文章通過ipsc進行體外誘導，分化為神經元，再進行細胞移植，治療先天性巨結腸，其流程復雜，且存在免疫排斥等風險，但是使用腸道自有的膠質前體細胞，省去了繁瑣的體外誘導和細胞移植過程，巨結腸遠端沒有神經元，但是有膠質前體細胞，利用體內膠質前體細胞轉分化為神經元，此方法是開創性的，且沒有倫理爭議，基因編輯和免疫排斥等風險，為體內治療巨結腸提供了全新的理論依據和治療方法。
技術實現思路
1、本專利技術提出了一種將腸神經嵴細胞誘導分化為膠質前體細胞的構建方法及應用，本方法將腸神經嵴細胞誘導分化為膠質前體細胞，并進一步誘導分化為神經元，為腸神經系統疾病的治療提供了工具細胞，且為理解腸道神經系統的發育和疾病提供了新的工具，同時也為開發新的治療方法提供了可能。
2、為了實現上述目的，本申請采用了如下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種將腸神經嵴細胞誘導分化為膠質前體細胞的構建方法，包括以下步驟：
4、s11：將腸神經嵴細胞培養4天形成神經球后，將含懸浮神經球的上清吸取出，離心，棄上清，用胰酶消化，加入dmem/f12培養基中止消化，離心，棄上清；
5、s12：用膠質前體細胞誘導培養基重懸神經球，接種到細胞培養瓶中，在37℃含5％co2的培養箱中培養；
6、s13：培養16h后，從培養箱中取出細胞，即得所述膠質前體細胞。
7、在以上技術方案中，所述膠質前體細胞誘導培養基的配制方法為：neurobasal培養基中加入1％的n2添加劑、2％的b27添加劑、1％的l-谷氨酰胺、10ng/ml的fgf2、10ng/ml的nrg1、3um的chir99021，混勻后用0.22um的無菌濾器過濾，即得所述膠質前體細胞誘導培養基。
8、第二方面，本專利技術提供了采用上述構建方法得到的所述膠質前體細胞應用于誘導分化為神經元。
9、在以上技術方案中，所述膠質前體細胞誘導分化為神經元的具體方法包括以下步驟：
10、s21：將所述膠質前體細胞離心，棄上清，用神經元誘導培養基重懸細胞，并接種到細胞培養瓶中，在37℃含5％?co2的培養箱中培養；
11、s22：培養32h后，從培養箱中取出細胞，即得所述神經元細胞。
12、在以上技術方案中，所述神經元誘導培養基的配制方法為：neurobasal培養基中加入1％的n2添加劑、2％的b27添加劑、1％的l-谷氨酰胺、1％的neaa添加劑、10ng/ml的bdnf、10ng/ml的gdnf、200um的ascorbic?acid，1mm的camp，混勻后用0.22um的無菌濾器過濾，即得所述神經元誘導培養基。
13、第三方面，本專利技術提供了一種將腸神經嵴細胞誘導分化為神經元的構建方法，包括以下步驟：
14、s31：將腸神經嵴細胞誘導分化為膠質前體細胞，具體方法為：
15、s311：將腸神經嵴細胞培養4天形成神經球后，將含懸浮神經球的上清吸取出，離心，棄上清，用胰酶消化，加入dmem/f12培養基中止消化，離心，棄上清；
16、s312：用膠質前體細胞誘導培養基重懸神經球，接種到細胞培養瓶中，在37℃含5％?co2的培養箱中培養；
17、s313：培養16h后，從培養箱中取出細胞，即得所述膠質前體細胞；
18、所述膠質前體細胞誘導培養基的配制方法為：neurobasal培養基中加入1％的n2添加劑、2％的b27添加劑、1％的l-谷氨酰胺、10ng/ml的fgf2、10ng/ml的nrg1、3um的chir99021，混勻后用0.22um的無菌濾器過濾，即得所述膠質前體細胞誘導培養基；
19、s32：將所述膠質前體細胞誘導分化為神經元，具體方法為：
20、s321：將所述膠質前體細胞離心，棄上清，用神經元誘導培養基重懸細胞，并接種到細胞培養瓶中，在37℃含5％?co2的培養箱中培養；
21、s322：培養32h后，從培養箱中取出細胞，即得所述神經元細胞；
22、所述神經元誘導培養基的配制方法為：neurobasal培養基中加入1％的n2添加劑、2％的b27添加劑、1％的l-谷氨酰胺、1％的neaa添加劑、10ng/ml的bdnf、10ng/ml的gdnf、200um的ascorbic?acid，1mm的camp，混勻后用0.22um的無菌濾器過濾，即得所述神經元誘導培養本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種將腸神經嵴細胞誘導分化為膠質前體細胞的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于：所述膠質前體細胞誘導培養基的配制方法為：Neurobasal培養基中加入1％的N2添加劑、2％的B27添加劑、1％的L-谷氨酰胺、10ng/ml的FGF2、10ng/ml的NRG1、3uM的CHIR99021，混勻后用0.22um的無菌濾器過濾，即得所述膠質前體細胞誘導培養基。
3.采用權利要求1-2任一項所述構建方法得到的所述膠質前體細胞應用于誘導分化為神經元。
4.根據權利要求3所述應用，其特征在于：所述膠質前體細胞誘導分化為神經元的具體方法包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述應用，其特征在于：所述神經元誘導培養基的配制方法為：Neurobasal培養基中加入1％的N2添加劑、2％的B27添加劑、1％的L-谷氨酰胺、1％的NEAA添加劑、10ng/ml的BDNF、10ng/ml的GDNF、200uM的Ascorbic?acid，1mM的cAMP，混勻后用0.22um的無菌濾器過濾，即得所述神經元誘導培
6.一種將腸神經嵴細胞誘導分化為神經元的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：
7.采用權利要求6所述構建方法得到的所述神經元在制備藥物中的應用，其特征在于：所述藥物用于治療腸神經系統疾病，所述藥物中包含所述神經元，通過細胞移植的方式，促進結腸遠端神經元的生長。
8.根據權利要求7所述應用，其特征在于：所述腸神經系統疾病包括先天性巨結腸及其同源病。
...【技術特征摘要】
1.一種將腸神經嵴細胞誘導分化為膠質前體細胞的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于：所述膠質前體細胞誘導培養基的配制方法為：neurobasal培養基中加入1％的n2添加劑、2％的b27添加劑、1％的l-谷氨酰胺、10ng/ml的fgf2、10ng/ml的nrg1、3um的chir99021，混勻后用0.22um的無菌濾器過濾，即得所述膠質前體細胞誘導培養基。
3.采用權利要求1-2任一項所述構建方法得到的所述膠質前體細胞應用于誘導分化為神經元。
4.根據權利要求3所述應用，其特征在于：所述膠質前體細胞誘導分化為神經元的具體方法包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述應用，其特征在于：所述神經元誘...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馮杰雄，余小四，陳緒勇，肖俊，周炳炎，向磊，王靜，吳路遙，李澤健，尤競怡，
申請(專利權)人：華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，
類型：發明
國別省市：
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