【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種生產(chǎn)7-脫氫膽固醇的重組釀酒酵母工程菌及應(yīng)用，屬于基因工程及生物工程。
技術(shù)介紹
1、7-脫氫膽固醇是一種存在于動物體內(nèi)的甾醇，在紫外照射下可以轉(zhuǎn)化為維生素d3。7-脫氫膽固醇是維生素d3的最重要前體。維生素d3因其具有提高機體免疫力與治療骨骼疾病等作用，其廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、飼料養(yǎng)殖等領(lǐng)域。此外7-脫氫膽固醇的c25位經(jīng)羥化酶轉(zhuǎn)化為25-羥基-7-脫氫膽固醇，該產(chǎn)物在紫外照射后生成維生素d3的活性形式，即25-羥基維生素d3。目前，國內(nèi)外25-羥基維生素d3和25-羥基-7-脫氫膽固醇生產(chǎn)率低，價格居高不下，因此高效生物合成7-脫氫膽固醇具有重要實用價值。由于目前國內(nèi)外的維生素d3及其衍生物等價格昂貴，在微生物體內(nèi)實現(xiàn)維生素d3的最重要前體7-脫氫膽固醇的高產(chǎn)具有重要意義。
2、7-脫氫膽固醇是動物體內(nèi)維生素d3代謝路徑的產(chǎn)物，7-脫氫膽固醇與釀酒酵母體內(nèi)的麥角甾醇功能與代謝路徑類似，在釀酒酵母中生產(chǎn)7-脫氫膽固醇可通過對釀酒酵母體內(nèi)麥角甾醇路徑的修飾來實現(xiàn)。因此釀酒酵母是甾體類等藥物生產(chǎn)的優(yōu)良宿主。此路徑可通過敲除麥角甾醇合成途徑中的erg5和erg6，并引入外源基因dhcr24可以實現(xiàn)在釀酒酵母中生產(chǎn)7-脫氫膽固醇，即引入7-脫氫膽固醇生產(chǎn)途徑。
3、相比于傳統(tǒng)化學(xué)方法制備7-脫氫膽固醇的價格昂貴，步驟繁瑣，耗能高等特點，通過微生物代謝方法生產(chǎn)7-脫氫膽固醇污染小、效率高并且降低了生產(chǎn)7-脫氫膽固醇的成本。由于目前微生物法生產(chǎn)7-脫氫膽固醇仍然存在產(chǎn)量低與生產(chǎn)成本高等問題，需要開發(fā)
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了一株高效合成7-脫氫膽固醇的釀酒酵母工程菌，在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上，整合表達(dá)了gallus?gallus來源的δ(24)-固醇還原酶基因dhcr24與基因erg2或基因erg3。
2、在一種實施方式中，所述釀酒酵母工程菌整合表達(dá)了gallus?gallus來源的δ(24)-固醇還原酶基因dhcr24與基因erg2，并整合表達(dá)了基因dhcr24和基因erg3。
3、在一種實施方式中，所述釀酒酵母工程菌還具有如下一種或多種改進：
4、(1)降低基因erg5和基因erg6的表達(dá)；
5、(2)降低基因rox1的表達(dá)；
6、(3)過表達(dá)如下一個或多個釀酒酵母內(nèi)源基因：erg2、erg3、thmg1、idi1、erg1、erg11、set2、hap4、tps1、erg25、erg26、erg27。
7、在一種實施方式中，所述釀酒酵母工程菌整合多拷貝的基因dhcr24。
8、在一種實施方式中，所述釀酒酵母工程菌整合4個拷貝的基因dhcr24。
9、在一種實施方式中，所述基因erg1、erg11和dhcr24整合在ty1位點。
10、在一種實施方式中，所述基因thmg1和idi1整合在ty3位點。
11、在一種實施方式中，所述基因set2和hap4整合在rph1位點。
12、在一種實施方式中，所述基因tps1、erg25、erg26和erg27整合在gal80位點。
13、在一種實施方式中，所述出發(fā)菌株包括但不限于釀酒酵母c800。
14、在一種實施方式中，用啟動子ptdh1啟動dhcr24基因的表達(dá)。
15、在一種實施方式中，所述基因dhcr24的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
16、在一種實施方式中，所述基因dhcr24和基因erg2整合在erg5位點。
17、在一種實施方式中，所述基因dhcr24和基因erg3整合在erg6位點。
18、在一種實施方式中，敲除釀酒酵母內(nèi)源基因rox1；所述基因rox1的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。
19、在一種實施方式中，用啟動子ptdh1起始dhcr24基因的表達(dá)。
20、在一種實施方式中，用啟動子ptef1起始erg2基因的表達(dá)；所述基因erg2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
21、在一種實施方式中，用啟動子ptdh3起始erg3基因的表達(dá)；所述基因erg3的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
22、在一種實施方式中，用啟動子pgal1起始thmg1基因的表達(dá)；所述基因thmg1的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。
23、在一種實施方式中，用啟動子pgal10起始idi1基因的表達(dá)；所述基因idi1的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。
24、在一種實施方式中，用啟動子ptef1起始erg1基因的表達(dá)；所述基因erg1的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。
25、在一種實施方式中，用啟動子ppgk1起始erg11基因的表達(dá)；所述基因erg11的核苷酸序列如seq?id?no.13所示。
26、在一種實施方式中，用啟動子ptdh3起始set2基因的表達(dá)；所述基因set2的核苷酸序列如seq?id?no.9所示。
27、在一種實施方式中，用啟動子ptdh1起始hap4基因的表達(dá)；所述基因hap4的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。
28、在一種實施方式中，用啟動子pgal7起始tps1基因的表達(dá)；所述基因tps1的核苷酸序列如seq?id?no.19所示。
29、在一種實施方式中，用啟動子ptef1起始erg25基因的表達(dá)；所述基因erg25的核苷酸序列如seq?id?no.20所示。
30、在一種實施方式中，用啟動子ppgk1起始erg26基因的表達(dá)；所述基因erg26的核苷酸序列如seq?id?no.21所示。
31、在一種實施方式中，用啟動子ptdh3起始erg27基因的表達(dá)；所述基因erg27的核苷酸序列如seq?id?no.22所示。
32、在一種實施方式中，啟動子ptef1的核苷酸序列如seq?id?no.14所示；啟動子ppgk1的核苷酸序列如seq?id?no.15所示；啟動子pgal1或啟動子pgal10的核苷酸序列如seq?id?no.16所示；啟動子ptdh1的核苷酸序列如seq?id?no.17所示；啟動子ptdh3的核苷酸序列如seq?idno.18所示；啟動子pgal7的核苷酸序列如seq?id?no.24所示。
33、本專利技術(shù)還提供了含有所述釀酒酵母工程菌的微生物制劑。
34、本專利技術(shù)還提供了一種制備7-脫氫膽固醇的方法，是將所述釀酒酵母工程菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
35、在一種實施方式中，將所述釀酒酵母工程菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30℃發(fā)酵。
36、在一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括但不限于ypd培養(yǎng)基。
37、在一種實施方式中，所述發(fā)酵過程還進行了本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種合成7-脫氫膽固醇的釀酒酵母工程菌，其特征在于，在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上，整合表達(dá)了Gallus?gallus來源的δ(24)-固醇還原酶基因DHCR24與基因ERG2或基因ERG3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌還具有如下一種或多種改進：
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，整合多拷貝的基因DHCR24。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，基因tHMG1和IDI1整合在Ty3位點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，基因SET2和HAP4整合在RPH1位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，基因TPS1、ERG25、ERG26和ERG27整合在GAL80位點。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述出發(fā)菌株包括但不限于釀酒酵母C800。
8.含有權(quán)利要求1～7任一所述釀酒酵母工程菌的微生物制劑。
9.一種制備7-脫氫
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，將所述釀酒酵母工程菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30℃發(fā)酵。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，發(fā)酵過程還進行補料；補料培養(yǎng)基含有葡萄糖、K+、Mg2+、Na+。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，補料培養(yǎng)基還含有鐵鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求9～12任一所述的方法，其特征在于，將所述釀酒酵母工程菌的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中；種子液的制備方法包括：將所述釀酒酵母工程菌菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，200～220rpm，28～30℃培養(yǎng)20-24h；
14.權(quán)利要求1～7任一所述的釀酒酵母工程菌，或權(quán)利要求8所述的微生物制劑，或權(quán)利要求9～13任一所述方法在制備7-脫氫膽固醇或含有7-脫氫膽固醇的藥物中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種合成7-脫氫膽固醇的釀酒酵母工程菌，其特征在于，在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上，整合表達(dá)了gallus?gallus來源的δ(24)-固醇還原酶基因dhcr24與基因erg2或基因erg3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌還具有如下一種或多種改進：
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，整合多拷貝的基因dhcr24。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，基因thmg1和idi1整合在ty3位點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，基因set2和hap4整合在rph1位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，基因tps1、erg25、erg26和erg27整合在gal80位點。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任一所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述出發(fā)菌株包括但不限于釀酒酵母c800。
8.含...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周景文，曾偉主，魏文倩，徐沙，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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