【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥，具體涉及一種mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法及其應用。
技術介紹
1、脊髓損傷是中樞神經系統(central?nervous?system，cns)的一種嚴重創傷性疾病，創傷、腫瘤或炎癥等因素導致脊髓完整性和連續性受到破壞，從而造成損傷水平以下的運動、感覺和自主神經功能障礙甚至造成全身其它器官的功能衰竭。脊髓損傷通常分兩個階段進行，第一階段為創傷直接引起的急性期損傷，隨后是亞急性期，其中各種因素如興奮性毒性損傷，出血，缺血和炎癥變化以及隨后的細胞壞死或凋亡，長期wallerian變性和疤痕形成等導致脊髓組織的繼發性損傷，嚴重限制損傷恢復，甚至加劇功能喪失。根據世界衛生組織的數據，全球每年有25萬到50萬人受到脊髓損傷的影響，且目前全球有超過100萬患者因脊髓損傷而癱瘓。近年來，脊髓損傷發生率逐年增加，約為每百萬人40-80例，且現有治療方法無法有效恢復脊髓損傷后的運動功能，除了治療費用高、預后差外，還會對患者造成嚴重的生理和心理傷害，給家庭和社會帶來巨大的負擔。
2、對于損傷后的治療一直是困擾人們的難題和研究的熱點。目前脊髓損傷的臨床治療僅限于手術減壓、激素沖擊療法以及神經保護治療等，但其臨床療效甚微，患者主要通過后期康復訓練維持殘存的神經功能，這主要是由于中樞神經系統可塑性較差，神經元固有的再生能力有限，脊髓損傷后的再生修復極其微弱，目前尚無有效的臨床治療措施可以完全恢復脊髓損傷后喪失的神經功能。再生修復已是當今醫學界亟待解決的世界難題，尋找有利于神經元再生的方法已成為脊髓
3、因此，亟需一種mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法及其應用，旨在突破當前治療瓶頸，促進神經功能恢復，為脊髓損傷的治療開辟新途徑。
技術實現思路
1、為此，本專利技術提供一種mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法及其應用，以解決現有技術中對星形膠質細胞增殖調控機制不明確、mirna靶向預測存在一定局限性的問題。
2、為了實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、根據本專利技術的第一方面，提供了一種mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因，mir-31調控星形膠質細胞增殖的關鍵下游靶基因為lats2，所述mir-31的序列如seq?idno.1所示，所述lats2的序列如seq?id?no.2所示。
4、根據本專利技術的第二方面，提供了一種mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，包括以下步驟：
5、s1.星形膠質細胞的分離：分離并培養星形膠質細胞，通過免疫熒光法鑒定星形膠質細胞標志物并檢測細胞純度；
6、s2.建立mir-31過表達模型：通過基因工程繁育并鑒定mir-31過表達陽性小鼠，同時在細胞水平上通過轉染技術構建mir-31過表達的星形膠質細胞模型；
7、s3.實時熒光定量pcr驗證轉染效率：采用rt-qpcr和cck-8實驗驗證mir-31轉染效率及對細胞增殖的影響；
8、s4.分子水平驗證與功能驗證。
9、進一步地，所述星形膠質細胞的特異性標志物為gfap，所述gfap與dapi結合后通過標記星形膠質細胞，以鑒定和確認星形膠質細胞的純度。
10、4.如權利要求2所述的mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，所述s1中星形膠質細胞的分離培養和純化包括以下步驟：
11、a.原代星形膠質細胞的提取與純化：從2-3天齡的fvb小鼠中分離脊髓組織，經消化、純化和培養，獲得高純度的原代星形膠質細胞；
12、b.傳代：在鏡下確認細胞長勢良好且匯合度達80％后，用pbs洗滌2次，加入胰酶消化3-5min后，用完全培養基終止消化，離心收集細胞并重懸后接種到新的培養瓶中；
13、c.凍存與復蘇：
14、將匯合度達90％的細胞用pbs洗滌細胞2次后，加入2ml胰酶消化3min，鏡下觀察細胞變圓后，用完全培養基終止消化，離心收集細胞并棄上清，用提前配好的凍存液凍存于-80℃，并在需要時通過快速解凍并用完全培養基重懸浮細胞后接種至培養瓶中；
15、從-80℃冰箱或液氮中取出細胞后，立即放入37℃水浴鍋中解凍2min，然后將細胞懸液轉移至含有完全培養基的離心管中混勻，離心后棄上清，用完全培養基重懸細胞并接種至培養瓶中。
16、進一步地，所述s1中免疫熒光法鑒定細胞純度包括以下步驟：
17、a.前期準備：將蓋玻片浸在75％酒精中浸泡一晚上，酒精燈烘干后放入六孔板中，配制0.1mg/ml多聚賴氨酸溶液，滴在蓋玻片上，放入培養箱4h后吸出，pbs洗3次，放入培養箱過夜烘干，并配置好bsa；
18、b.細胞培養和固定：前一天將細胞重懸于蓋玻片上，每個孔3×105個細胞，放置在培養箱中過夜，從培養箱中取出六孔板，棄去培養基，用pbs洗2次，用4％多聚甲醛固定20-40min，pbs洗2-3次；
19、c.免疫熒光染色：
20、每孔加入200μl?tritonx-100，室溫通透20min，pbs洗2-3次，每次2-5min；
21、加入1mlbsa封閉1h，pbs洗2-3次；
22、加入一抗，4℃過夜孵育，常溫放1h到室溫，pbs洗2-3次，每次8-12min；加入二抗，室溫避光孵育1.5-2.5h，pbs洗2-3次，每次10min；
23、加dapi孵育10min，pbs洗2-3次，每次55min，封片；
24、d.觀察和計算：在熒光顯微鏡下觀察拍照，細胞純度為gfap顯色的細胞數量與dapi顯色的細胞數量之比。
25、進一步地，所述s2中構建mir-31過表達的星形膠質細胞模型包括以下步驟：
26、(1)將準備好的星形膠質細胞接種于在六孔板中，然后用含10％?fbs和1％雙抗的完全培養基在培養箱中孵育8-16h；
27、(2)稀釋轉染試劑，吹打3-5次混勻，稀釋sirna吹打3-5次混勻并靜置3-8min，混合兩個液體，吹打3-5次混勻，室溫靜置15-25min得到混合試劑；
28、(3)從培養箱中取出細胞，pbs清洗細胞2-3次后吸除殘留的pbs，每個孔加1500μl不含雙抗的含12％?fbs的培養基，將(2)中得到的混合試劑滴到孔里，輕搖板混合，培養箱中放3-6h后更換含雙抗的完全培養基，12-24h后做后續操作。
29、進一步地，所述步驟(2)中每6μl?lipofectamine?2000轉染試劑用250μlopti-mem稀釋，每5μl?sirna用250μlopti-mem稀釋。
30、進一步地，所述s4中分子水平驗證通過基因表達分析、測序、熒光素酶報告基因試驗驗證mir-31調控機制，功能驗證通過細胞增殖實驗、蛋白質表達分析評估mir-31的功能效果。
31、根據本專利技術本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因，其特征在于，miR-31調控星形膠質細胞增殖的關鍵下游靶基因為LATS2，所述miR-31的序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述LATS2的序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.一種miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述星形膠質細胞的特異性標志物為GFAP，所述GFAP與DAPI結合后通過標記星形膠質細胞，以鑒定和確認星形膠質細胞的純度。
4.如權利要求2所述的miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述S1中星形膠質細胞的分離培養和純化包括以下步驟：
5.如權利要求4所述的miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述S1中免疫熒光法鑒定細胞純度包括以下步驟：
6.如權利要求2所述的miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述S2中構建miR-31過表達的星形膠質細
7.如權利要求6所述的miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述步驟(2)中每6μL?Lipofectamine?2000轉染試劑用250μLOpti-Mem稀釋，每5μLsiRNA用250μLOpti-Mem稀釋。
8.如權利要求2所述的miR-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述S4中分子水平驗證通過基因表達分析、測序、熒光素酶報告基因試驗驗證miR-31調控機制，功能驗證通過細胞增殖實驗、蛋白質表達分析評估miR-31的功能效果。
9.miR-31在制備用于脊髓損傷修復過程的藥物或組合物中的應用。
10.miR-31在制備用于治療因脊髓損傷所致神經退行性疾病的藥物或組合物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因，其特征在于，mir-31調控星形膠質細胞增殖的關鍵下游靶基因為lats2，所述mir-31的序列如seq?id?no.1所示，所述lats2的序列如seq?id?no.2所示。
2.一種mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述星形膠質細胞的特異性標志物為gfap，所述gfap與dapi結合后通過標記星形膠質細胞，以鑒定和確認星形膠質細胞的純度。
4.如權利要求2所述的mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述s1中星形膠質細胞的分離培養和純化包括以下步驟：
5.如權利要求4所述的mir-31調控星形膠質細胞增殖的靶基因的篩選方法，其特征在于，所述s1中免疫熒光法鑒定細胞純度包括以下步驟：
【專利技術屬性】
技術研發人員：原一桐，林穎，杜若琛，王佳微，王春芳，
申請(專利權)人：山西醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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