【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫(yī)藥領域，尤其是涉及一種人胸腺原代細胞分離試劑盒及分離方法。
技術介紹
1、胸腺是重要的中樞免疫器官，胸腺不僅僅是t細胞發(fā)育和成熟的場所，并且還通過陽性選擇、陰性選擇和產(chǎn)生treg細胞介導機體的免疫耐受。這一過程精密復雜，需要胸腺上皮細胞、樹突狀細胞、b細胞和胸腺細胞的協(xié)同參與。胸腺在嬰兒期相對較大，在人類青春期達到35至40克。此后胸腺開始退化并逐漸萎縮被脂肪組織代替，由此導致的t細胞輸出減少與年齡相關的癌癥、感染和自身免疫發(fā)病率有關。
2、來自胎肝或骨髓的t細胞前體遷移到胸腺，然后再分化為不同類型的成熟t細胞。胸腺精密的微環(huán)境協(xié)同支持t細胞分化。盡管胸腺上皮細胞提供了促進t細胞命運的關鍵線索，但其他類型的細胞也參與了這一過程，如進行抗原呈遞的樹突狀細胞和支持tec分化和維持的髓質(zhì)b細胞。自上個世紀60年代以來，在動物模型中進行的開創(chuàng)性實驗對胸腺的功能和細胞組成提供了重要的幫助。然而人類器官成熟的模式和節(jié)奏是我們物種所獨有的，這就需要對人類胸腺進行更加深入的研究。對正常胸腺功能的研究因為胸腺組織樣本珍貴，胸腺原代培養(yǎng)成功率低和缺乏可供實驗使用的細胞系而難以更進一步。
3、由于胸腺介導的免疫耐受中的機制微妙而又復雜，任何影響胸腺正常結(jié)構(gòu)功能的疾病均可能導致免疫耐受的失敗，即自身免疫的產(chǎn)生。大量研究已經(jīng)證明，胸腺疾病與多種自身免疫性疾病的發(fā)生存在聯(lián)系，如重癥肌無力、干燥綜合征、純紅細胞再生障礙性貧血等。有研究表明，與胸腺疾病相關的自身免疫性疾病多達123種。因此，研究胸腺疾病導致自身免疫性
4、無論是對胸腺正常功能的探索還是對胸腺疾病與自身免疫性疾病的關系的研究均面臨著一個重要的技術問題——正常胸腺細胞成分的分離與培養(yǎng)。目前最常用的研究方法為胰酶消化法與組織塊直接培養(yǎng)法。前者是將在組織通過胰酶消化后直接用于培養(yǎng)，這種方法使用胰蛋白酶消化組織，容易損傷原代細胞，分離的細胞不易成活，成功率低；后者較前者成功率稍高，但所需時間長，分離成功往往需要2周以上的時間，且培養(yǎng)成功的原代細胞與組織塊難以分離，不利于后續(xù)實驗。此外，因為胸腺中含有大量t淋巴細胞及其前體，導致其他細胞成分占比較低，這兩種方法均無法將各種細胞成分精確提純分離，故不適合用于胸腺組織的原代培養(yǎng)。這兩種方法在成功率、靈敏性、特異性和可重復性等方面存在諸多問題。
技術實現(xiàn)思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供一種人胸腺原代細胞分離試劑盒及分離方法。
2、本專利技術采用的技術方案是：一種胸腺組織細胞分離試劑盒，包括提取試劑和分選試劑，提取試劑包括：
3、提取試劑a，包括2-3g/l?hepes、0.5-1g/l?edta、50-100u/ml?青鏈霉素，ph值為7.0-7.5；
4、提取試劑b：包括10-20ml/l?hepes、2.5-5g/l牛血清白蛋白、50?-75mg/l胰蛋白酶抑制劑、0.1-0.2g/l丁酸、1-2mmol/l?l-谷氨酰胺、1-2mg/ml亞油酸；ph值為7.0-7.5；
5、提取試劑c：包括3-4mg/ml膠原酶i、5-10ug/ml透明質(zhì)酸酶、0.1-0.2mg/ml脫氧核糖核酸酶i，ph值為7.0-7.5；
6、提取試劑d：含體積比50%-60%的percoll原液、1-2mol/l氯化鈉，ph值為7.0-7.5；
7、分選試劑包括分選試劑a、分選試劑b、分選試劑c、分選試劑d和分選試劑e中的兩種或多種的組合，其中，
8、分選試劑a為生物素標記的抗cd45單克隆抗體；
9、分選試劑b為生物素標記的抗cd19單克隆抗體；
10、分選試劑c為與鏈霉親和素偶聯(lián)的超順納米磁珠；
11、分選試劑d為藻紅蛋白標記的抗cd11c單克隆抗體；
12、分選試劑e：為抗藻紅蛋白的超順納米磁珠。
13、優(yōu)選地，分選試劑包括分選試劑a、分選試劑b、分選試劑c、分選試劑d和分選試劑e；
14、或者分選試劑包括分選試劑a和分選試劑c；
15、或者分選試劑包括分選試劑a、分選試劑c、分選試劑d和分選試劑e；
16、或者分選試劑包括分選試劑b和分選試劑c。
17、使用試劑盒分離胸腺組織中細胞的方法，先通過提取試劑處理胸腺組織，制備得到胸腺組織單細胞懸液，再通過分選試劑以免疫磁珠法富集得到胸腺上皮細胞、胸腺樹突狀細胞、胸腺t細胞和胸腺b細胞中的一種或多種。
18、優(yōu)選地，胸腺組織單細胞懸液制備具體步驟如下：
19、步驟1：將胸腺組織樣本置于容器中，加入提取試劑a洗滌，無菌操作切碎呈約為1mm3大小，反復吹打后移至50ml離心管中，傾斜靜置10min，棄上清；
20、步驟2：加入10ml提取試劑b混勻，靜置10min，棄上清；
21、步驟3：加入10ml提取試劑c，加入無菌處理的磁力轉(zhuǎn)子，置于37℃的磁力攪拌器上攪拌，轉(zhuǎn)速為100-120?rpm/min，時間為10?min；
22、步驟4：傾斜靜置15min，通過巴氏管棄去上清液，加入10ml提取試劑a，反復吹打后靜置15min；
23、步驟5：棄上清，加入10ml?提取試劑c，加入無菌處理的磁力轉(zhuǎn)子，置于37℃的磁力攪拌器上攪拌，轉(zhuǎn)速為100-120?rpm/min，時間為30?min；
24、步驟6：將所得溶液經(jīng)70μm無菌細胞篩過濾，在室溫下以800-1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5-10min；
25、步驟7：棄上清，再次加入15ml提取試劑a，移液管充分混勻，在室溫下以800-1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5-10min，棄上清，加入5-10ml提取試劑b充分混勻；
26、步驟8：將所得溶液緩慢滴加到提取試劑d中，溶液與提取試劑d的體積比是0.75-1:1，在4℃下以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心30-50min，升降速度為0；
27、步驟9：無菌吸取低密度細胞層細胞，轉(zhuǎn)移至含有提取試劑b的離心管中備用，所得細胞為含有胸腺上皮細胞和胸腺樹突狀細胞的胸腺基質(zhì)細胞；
28、無菌吸取高密度細胞層細胞，轉(zhuǎn)移至含有提取試劑b的離心管中備用，所得細胞為含有各發(fā)育階段的胸腺t細胞和胸腺b細胞。
29、優(yōu)選地，分離胸腺原代上皮細胞步驟包括：
30、步驟10：向步驟9中獲得的低密度細胞層細胞中加入適量分選試劑a充分混勻，于4℃下避光孵育20min后，加入適量分選試劑c充分混勻，于4℃下避光孵育30min后，加入到pbs潤洗后的磁力分選柱上，未與分選柱結(jié)合的細胞即為胸腺原代上皮細胞；
31、優(yōu)選地，分離胸腺原代樹突狀本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種人胸腺原代細胞分離試劑盒，其特征在于：包括提取試劑和分選試劑，提取試劑包括：
2.根據(jù)權利要求1所述的人胸腺原代細胞分離試劑盒，其特征在于：分選試劑包括分選試劑A、分選試劑B、分選試劑C、分選試劑D和分選試劑E；
3.使用權利要求1或2所述的試劑盒分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：先通過提取試劑處理胸腺組織，制備得到胸腺組織單細胞懸液，再通過分選試劑以免疫磁珠法富集得到胸腺上皮細胞、胸腺樹突狀細胞、胸腺T細胞和胸腺B細胞中的一種或多種。
4.根據(jù)權利要求3所述的分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：胸腺組織單細胞懸液制備具體步驟如下：
5.根據(jù)權利要求4所述的分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：分離胸腺原代上皮細胞步驟包括：
6.根據(jù)權利要求4所述的分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：分離胸腺原代樹突狀細胞步驟包括：
7.根據(jù)權利要求4所述的分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：分離胸腺T細胞和胸腺B細胞的步驟包括：
8.根據(jù)權利要求5-7中任一所述的分離人胸腺原代細胞的方法，其特
9.采用權利要求3-8中任一所述的分離人胸腺原代細胞的方法分離得到的胸腺上皮細胞、胸腺樹突狀細胞、胸腺T細胞和胸腺B細胞中的一種或多種的組合。
10.權利要求1或2所述的試劑盒，或者權利要求3-8中任一所述的分離人胸腺原代細胞的方法在分離純化人胸腺組織中B淋巴細胞、T淋巴細胞、上皮細胞和樹突狀細胞中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種人胸腺原代細胞分離試劑盒，其特征在于：包括提取試劑和分選試劑，提取試劑包括：
2.根據(jù)權利要求1所述的人胸腺原代細胞分離試劑盒，其特征在于：分選試劑包括分選試劑a、分選試劑b、分選試劑c、分選試劑d和分選試劑e；
3.使用權利要求1或2所述的試劑盒分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：先通過提取試劑處理胸腺組織，制備得到胸腺組織單細胞懸液，再通過分選試劑以免疫磁珠法富集得到胸腺上皮細胞、胸腺樹突狀細胞、胸腺t細胞和胸腺b細胞中的一種或多種。
4.根據(jù)權利要求3所述的分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：胸腺組織單細胞懸液制備具體步驟如下：
5.根據(jù)權利要求4所述的分離人胸腺原代細胞的方法，其特征在于：分離胸腺原代上皮細胞步驟包括：
6.根據(jù)權...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張鵬，熊楷，陳建梅，張鵬，張皓喆，
申請(專利權)人：天津醫(yī)科大學總醫(yī)院空港醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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