【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及分子遺傳標記，具體涉及一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記及其應用。
技術介紹
1、中國擁有豐富的地方豬品種資源，以地方豬為素材培育的特色品種能充分滿足多元化市場消費需求，同時我國又是豬肉生產(chǎn)和消費大國，豬肉是我國居民攝取蛋白質(zhì)營養(yǎng)的主要來源，在居民生活和經(jīng)濟生產(chǎn)中扮演著舉足輕重的作用。民豬是我國東北地區(qū)特有的地方豬種，具有耐寒、肉質(zhì)優(yōu)良、繁殖力高等優(yōu)點。但在一些胴體性狀上顯著低于大白豬等引進豬種，如瘦肉率、眼肌面積、剪切力等胴體性狀。
2、骨骼肌生長發(fā)育是一個復雜的過程，涉及到肌肉前體細胞增殖、成肌細胞分化和多核肌管形成。在這些發(fā)育事件中，細胞與細胞、細胞與組織及細胞與胞外基質(zhì)間的相互作用是必不可少的，這一過程涉及到了大量的細胞粘附和遷移。骨骼肌衛(wèi)星細胞是一種肌源性干細胞，在動物生后的肌肉發(fā)育和損傷修復中發(fā)揮重要作用，同時與產(chǎn)肉家畜的胴體性狀、肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)密切相關。
3、小窩蛋白(secretory?leukocyte?peptidase?inhibitor,cav1)是一種22kda的膜蛋白，對于在質(zhì)膜中形成小的內(nèi)陷(小窩)至關重要。cav1基因主要在內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞中表達，其通過調(diào)節(jié)膜運輸、膽固醇代謝和細胞信號轉(zhuǎn)導來發(fā)揮自身的調(diào)節(jié)作用。
4、近年來研究發(fā)現(xiàn)，cav1在生命活動中發(fā)揮重要作用，cav1在肌肉前體細胞增殖和分化過程中發(fā)揮著重要作用；cav1可以通過wnt/β-catenin通路誘導emt過程，促進肝癌細胞轉(zhuǎn)移；cav1能夠正向調(diào)
5、曾國偉等2015年發(fā)表于“解放軍醫(yī)學院學報”的《小窩蛋白在骨骼肌肉系統(tǒng)中的研究進展》給出了：雖然小窩和小窩蛋白已經(jīng)研究了50多年，但其在骨骼和肌肉系統(tǒng)中的作用研究只在起步階段。許多研究證實，caveolin-1和caveolin-2共表達在成纖維細胞、平滑肌細胞和成骨細胞上。caveolin-3特異地表達在心肌細胞、平滑肌細胞和骨骼肌細胞上。衛(wèi)星細胞是靜態(tài)的肌細胞前體，在肌細胞受到損傷時其有絲分裂被激活，衛(wèi)星細胞增殖、融合或形成新的肌纖維，從而開啟了肌再生的關鍵步驟。volonte等證實，caveolin-1的下調(diào)確實是肌再生中衛(wèi)星細胞激活的一個關鍵信號。雖然caveolin-1毫無疑問地參與到骨生成、骨成熟和骨量調(diào)節(jié)的過程中，但是caveolin-1在其中發(fā)揮的具體作用和相關機制仍然不明確。一方面，caveolin-1作為成骨分化的抑制因子，抑制骨骼成熟和礦化；另一方面，caveolin-1通過與成骨細胞外基質(zhì)和鈣離子敏感受體相互作用減弱破骨細胞介導的骨溶解過程。關于caveolins對骨組織影響生理學意義和相關調(diào)控機制有待進一步闡明。
6、該文章雖然給出了小窩蛋白cav1與骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的關系，但是如何利用小窩蛋白cav1進行與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的選育，并沒有涉及。因此，需要一種能夠篩選出豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的snp進行豬的選育工作。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術篩選出了一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的snp。選擇cav1作為候選基因，通過尋找豬cav1基因3utr區(qū)域的遺傳變異，篩選一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的分子標記，利用該分子標記進行豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的標記輔助選擇及應用。
2、本專利技術的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記，所述的分子標記為cav1基因3’utr區(qū)域第+215位堿基處發(fā)生單核苷酸突變形成的如seq?id?no.1所示的核苷酸序列；所述的單核苷酸突變的多態(tài)性表現(xiàn)為t/c多態(tài)性。
3、進一步地，所述的t/c多態(tài)性影響豬肌肉發(fā)育。
4、進一步地，所述的t/c多態(tài)性為c到t的突變；其中，tt基因型個體的cav1基因表達量顯著高于cc基因型個體。
5、本專利技術的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記的應用，所述的分子標記用于選育/輔助選育與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的豬品種或品系。
6、進一步地，所述的選育/輔助選育是選擇cav1基因3’utr區(qū)域第+215位為cc基因型個體的豬，作為目標豬，進行育種。
7、進一步地，所述的豬為民豬或大白豬。
8、進一步地，所述的選育/輔助選育是選擇cav1基因3’utr區(qū)域第+215位為cc基因型個體的豬，作為目標豬，進行育種，具體操作如下：
9、一、獲得待檢測豬的基因組dna；
10、二、以上述豬基因組dna為模板，采用如下引物對進行pcr擴增，獲得含有snp位點的cav1基因3’utr區(qū)域的基因片段；
11、引物cav1_f1：5′-gtgacatttcaagggtataagtat-3′；
12、引物cav1_r1：5′-aactgttaaacatttttattgtgc-3′；
13、三、通過瓊脂糖凝膠電泳對上述擴增產(chǎn)物進行檢測；
14、四、對pcr產(chǎn)物進行測序分析；
15、五、選擇cav1基因3’utr區(qū)域第+215位點的基因型為cc的豬，即為篩選出的目標；
16、六、對篩選出的目標豬進行育種，即完成。
17、本專利技術的一種檢測所述的與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記的引物對，所述的引物序列如下：
18、引物cav1_f1：5′-gtgacatttcaagggtataagtat-3′；
19、引物cav1_r1：5′-aactgttaaacatttttattgtgc-3′。
20、包含上述所述的引物的試劑盒。
21、本專利技術利用高通量測序技術分析了豬肌肉發(fā)育的遺傳基礎，發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)育時期的背最長肌中，小窩蛋白-1(caveolin-1,cav1)基因的表達量存在著顯著差異，提示cav1在肌肉發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。
22、本專利技術進一步對cav1基因進行了遺傳多態(tài)性分析，通過pcr產(chǎn)物直接測序發(fā)現(xiàn)豬cav1基因3’utr+215位點存在著c到t的突變，在民豬中該突變以較高的頻率存在，在33頭民豬中，c和t等位基因頻率分別為0.53和0.47，而在17頭大白豬中，c和t等位基因頻率分別為0.76和0.24。本專利技術進一步利用熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸?215位點的c>t多態(tài)性的遺傳效應進行了深入分析，發(fā)現(xiàn)+215位點的c到t突變在體外試驗中改變了cav1?3’utr的活性，突變cav1基因+215位點(c突變?yōu)閠)后，熒光素酶報告基因活性顯著上升，提示該點突變有促進cav1基因轉(zhuǎn)錄表達的功能；
23、本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的CAV1基因分子標記，其特征在于所述的分子標記為CAV1基因3’UTR區(qū)域第+215位堿基處發(fā)生單核苷酸突變形成的如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；所述的單核苷酸突變的多態(tài)性表現(xiàn)為T/C多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的CAV1基因分子標記，其特征在于所述的T/C多態(tài)性影響豬肌肉發(fā)育。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的CAV1基因分子標記，其特征在于所述的T/C多態(tài)性為C到T的突變；其中，TT基因型個體的CAV1基因表達量顯著高于CC基因型個體。
4.如權(quán)利要求1所述的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的CAV1基因分子標記的應用，其特征在于所述的分子標記用于選育/輔助選育與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的豬品種或品系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述的選育/輔助選育是選擇CAV1基因3’UTR區(qū)域第+215位為CC基因型個體的豬，作為目標豬，進行育種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應用，其特征在于所述的豬為民豬或
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應用，其特征在于所述的選育/輔助選育是選擇CAV1基因3’UTR區(qū)域第+215位為CC基因型個體的豬，作為目標豬，進行育種，具體操作如下：一、獲得待檢測豬的基因組DNA；
8.一種檢測權(quán)利要求1所述的與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的CAV1基因分子標記的引物對，其特征在于所述的引物序列如下：
9.包含權(quán)利要求8所述的引物的試劑盒。
...【技術特征摘要】
1.一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記，其特征在于所述的分子標記為cav1基因3’utr區(qū)域第+215位堿基處發(fā)生單核苷酸突變形成的如seq?id?no.1所示的核苷酸序列；所述的單核苷酸突變的多態(tài)性表現(xiàn)為t/c多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記，其特征在于所述的t/c多態(tài)性影響豬肌肉發(fā)育。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記，其特征在于所述的t/c多態(tài)性為c到t的突變；其中，tt基因型個體的cav1基因表達量顯著高于cc基因型個體。
4.如權(quán)利要求1所述的一種與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關的cav1基因分子標記的應用，其特征在于所述的分子標記...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：楊秀芹，龐宇，榮博涵，林旭，吳曉旭，田明，
申請(專利權(quán))人：東北農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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