【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體涉及一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白、制備方法、試劑盒及應用。
技術介紹
1、目前全球已有大量研究證實了塵螨與過敏性哮喘、過敏性鼻炎、濕疹等過敏性疾病密切相關。塵螨在全世界各個國家都有分布，全世界范圍內最為常見的塵螨種類是屋塵螨和粉塵螨。免疫學研究證明，i類過敏原蛋白是引發塵螨過敏性疾病的主要因素，超過80％的塵螨過敏患者對i類過敏原蛋白(粉塵螨i類過敏原der?f?1和屋塵螨i類過敏原蛋白der?p1)的皮膚點刺試驗和血清特異性ige檢測呈陽性。
2、血清特異性ige檢測作為一種安全、有效、便捷的檢測手段，已經廣泛應用于過敏性疾病的診斷。過敏原皮膚點刺試驗作為懷疑ⅰ型過敏性疾病時的過敏原一線檢測方法，也常用于了解不同地區人群致敏率、過敏原變化趨勢，但重復性較差、操作繁瑣，具有檢查有創性的特點，同時容易受操作者的技術影響，判定結果有主觀性等，因此臨床上需要一種重復性好，自動化，靈敏度度高，特異性強的診斷方法。化學發光免疫分析技術是近二十年來發展非常迅速的非放射免疫測定技術，是繼酶免技術、放免技術、熒光免疫技術和時間分辨免疫分析之后發展起來的最新的免疫測定技術，分為酶促化學發光和非酶促化學發光；而磁微粒化學發光法是一種結合了磁性分離技術、酶促化學發光技術和免疫分析技術的新興分析方法，在該方法中，化學反應釋放的自由能激發中間體，如堿性磷酸酶-金剛烷、辣根過氧化物酶-魯米諾衍生物等，從激發態回到基態。在這個過程中，中間體釋放等能級的光子，通過對這些光子的測定進行定量分析，提高了檢測的靈敏度和特異
3、過敏原血清特異性ige檢測試劑大都采用粗提物，測量的是與該種過敏原中所有蛋白質成分結合的ige“總和”。這些粗提物由于提取方法、后期處理及保存方法的差異，可能出現部分組分缺失或雜質蛋白較多的現象，因此容易導致漏檢；另外，粗提物中可能會存在與真正過敏原具有相似抗原表位的物質，這些相似的抗原表位可引起交叉反應而出現假陽性的結果；由于粗提物中含有多種過敏原組分，同一組分在不同批次產品中的含量不一致，不利于控制產品批間差。
4、因此，有必要開發重組組分過敏原來鑒定引起過敏反應的特定ige，使得過敏性疾病的診斷更加精準。
技術實現思路
1、本專利技術是為了解決使用粗提物進行過敏原檢測導致檢測結果不夠精準的技術問題，目的在于提供一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白、制備方法、試劑盒及應用，該重組蛋白生物活性高，可應用到制備磁微粒化學發光檢測試劑盒中，檢測準確度高，試劑盒穩定性好。
2、本專利技術通過下述技術方案實現。
3、本專利技術的第一個目的在于提供一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白，具有如seq?idno.1所示的氨基酸序列。
4、本專利技術的第二個目的在于提供一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：
5、設計一對擴增der?p?1的特異性引物，通過pcr進行擴增，回收目的條帶；
6、將目的條帶與克隆載體連接，轉化到感受態細胞培養，提取得到含目的基因的重組質粒；將重組質粒克隆到原核表達載體，得到含目的基因的表達載體；
7、將含目的基因的表達載體轉化到宿主細胞中，誘導表達，純化，得到der?p?1重組蛋白。
8、進一步地，所述的特異性引物為：
9、上游引物為5’ggatccgaattcctttttttttctttctctctc3’；
10、下游引物為5’gcccaagctttaatttttgtgaatgaatttattc3’。
11、進一步地，將重組質粒克隆到原核表達載體，得到含目的基因的表達載體包括：
12、利用限制性內切酶ndeⅰ和pstⅰ分別切割含目的基因的重組質粒和原核表達載體產生的粘性末端，在t4dna鏈接酶的作用下，構建得到含目的基因的表達載體。
13、進一步地，所述原核表達載體采用pet28a。
14、本專利技術的第三個目的在于提供一種試劑盒，包括所述的der?p?1重組蛋白。
15、進一步地，所述der?p?1重組蛋白采用過氧亞硝酸鹽溶液硝基化處理。
16、進一步地，硝基化時，過氧亞硝酸鹽溶液中onoo-與der?p?1重組蛋白中酪氨酸的摩爾濃度比值為(1-15):1，反應溫度為3-5℃，反應時間為100-140min。
17、進一步地，包括磁珠試劑、生物素化的der?p?1重組蛋白、堿性磷酸酶標記的鼠抗人ige抗體。
18、本專利技術的第四個目的在于提供一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白在用于制備檢測屋塵螨的診斷試劑或脫敏治療的生物制品方面的應用。
19、本專利技術與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果：
20、本專利技術通過對der?p?1重組蛋白進行硝基化處理，提升硝基化產物與特異性ige的結合能力，有效提高der?p?1檢測試劑盒的靈敏度，解決天然提取過敏原免疫原性降低，蛋白偶聯后與特異性ige的結合能力低等問題；采用原核表達系統與硝基化的組合，提高derp?1重組蛋白與天然蛋白的ige結合，可進一步提高蛋白的生物活性，并且提高表達產量、縮短表達周期、降低成本；同時，可應用到制備磁微粒化學發光檢測試劑盒中，能有效解決目前市面上過敏原粗提物批間差大，過敏原蛋白組分缺失導致漏檢，過敏患者過敏組分不明確等問題，達到提供穩定原料，降低試劑盒批間差，明確患者塵螨過敏具體組分的目的，且試劑盒準確度高，穩定性好。
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1.一種塵螨過敏原Der?p?1重組蛋白，其特征在于，具有如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。
2.一種塵螨過敏原Der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種塵螨過敏原Der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的特異性引物為：
4.根據權利要求2所述的一種塵螨過敏原Der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，將重組質粒克隆到原核表達載體，得到含目的基因的表達載體包括：
5.根據權利要求2-4任一項所述的一種塵螨過敏原Der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述原核表達載體采用pET28a。
6.一種試劑盒，包括如權利要求1所述的Der?p?1重組蛋白。
7.根據權利要求6所述的一種試劑盒，其特征在于，所述Der?p?1重組蛋白采用過氧亞硝酸鹽溶液硝基化處理。
8.根據權利要求7所述的一種試劑盒，其特征在于，硝基化時，過氧亞硝酸鹽溶液中ONOO-與Der?p?1重組蛋白中酪氨酸的摩爾濃度比值為(1-15):1，反應溫度為3-5℃，反
9.根據權利要求7或8所述的一種試劑盒，其特征在于，包括磁珠試劑、生物素化的Derp1重組蛋白、堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE抗體。
10.如權利要求1所述的一種塵螨過敏原Der?p?1重組蛋白在用于制備檢測屋塵螨的診斷試劑或脫敏治療的生物制品方面的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白，其特征在于，具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。
2.一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的特異性引物為：
4.根據權利要求2所述的一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，將重組質粒克隆到原核表達載體，得到含目的基因的表達載體包括：
5.根據權利要求2-4任一項所述的一種塵螨過敏原der?p?1重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述原核表達載體采用pet28a。
6.一種試劑盒，包括如權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫寶清，黃惠敏，羅文婷，鄭佩燕，程章愷，黃志鋒，張嘉樂，黎明，
申請(專利權)人：廣州醫科大學附屬第一醫院廣州呼吸中心，
類型：發明
國別省市：
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