【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物，具體涉及一種寡營養hn-ad菌的篩選培養基和快篩方法。
技術介紹
1、水體含氮污染物主要包括氨氮(nh4+-n/nh3)、亞硝酸鹽氮(no2--n)和硝酸鹽氮(no3--n)。高濃度的氮污染不僅會造成水體富營養化，危害水生生物，破壞生態平衡，還嚴重威脅著人和水生動物健康安全。近年來，水體含氮污染物的高效去除已成為全球關注的研究熱點。
2、微生物技術具有安全、環保、經濟、高效等優點，是目前較為理想的水體污染物原位消減技術之一。傳統生物脫氮技術以氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌為自養好氧細菌，反硝化菌為異養厭氧細菌，需要將硝化和反硝化分區進行，其運行成本較高，工藝繁雜且作用時間長，外界因素對其影響較大，容易造成二次污染。異養硝化-好氧反硝化(heterotrophicnitrification-aerobic?denitrifying，hn-ad)細菌的發現有效解決了硝化反硝化分區的問題，這類細菌具有同步硝化和反硝化的特性，在好氧條件下可在一個反應器中實現氨氮和總氮同步脫除，一定程度上彌補了傳統生物脫氮受氧限制的短板。
3、目前，已從各種環境中分離出許多具有hn-ad能力的菌屬，而碳氮比是影響hn-ad脫氮效率的關鍵參數之一。當前，地表水(河流、湖泊、水庫等)、城鎮污水及水產養殖廢水普遍存在低碳氮比現象。一般認為cod/tn＜8(或者bod/tn＜5)的污水即為低碳氮比污水。由于低碳氮比廢水中碳源能量嚴重不足，利用hn-ad去除氮素很難達到預期效果。因此，篩選出適用于低碳氮比水體氮污染去除的hn
4、寡營養菌是一類在營養物質濃度很低環境條件生長的微生物，通常定義為初次培養時能夠在含碳1-15mg/l培養基上生長的細菌。該類菌具有穩定的特殊機能和遺傳基因，對營養物質的需求低，在寡營養環境中的脫氮及環境耐受能力強，因而在處理低c/n比水體時具有獨特的優勢。現有技術中hn-ad菌株大多采用高營養培養基進行富集和篩選，過程費時費力，且分離出的菌株不適合處理低碳氮比水體。因此，建立一種快速高效、針對性強的低碳寡營養hn-ad菌的篩選方法是現階段需解決的技術問題。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種寡營養hn-ad菌的篩選培養基和快篩方法，該方法篩選出的菌株可有效去除低碳氮比水體氮污染，提高了低碳氮比水體氮污染處理效率，降低了成本。
2、為解決上述技術問題，本專利技術提供了以下技術方案：
3、本專利技術提供一種寡營養hn-ad菌的篩選培養基，包括hnm培養基、dm培養基和btb培養基，hnm培養基配方包括：(nh4)2so40.014-0.47g，檸檬酸三鈉0.053-1.80g，k2hpo4·3h2o0.10-0.30g，mgso4·7h2o?0.03-0.07g，nacl0.08-0.16g，feso4·7h2o?0.005-0.015g，mnso4·h2o?0.005-0.015g，cacl20.03-0.07g，蒸餾水1000ml，調整ph為6.8-7.2；dm培養基配方包括：kno30.5-0.72g，檸檬酸三鈉1.60-2.0g，k2hpo4·3h2o?0.10-0.30g，mgso4·7h2o0.03-0.07g，nacl?0.08-0.16g，feso4·7h2o?0.005-0.015g，mnso4·h2o?0.005-0.015g，cacl20.03-0.07g，蒸餾水1000ml，調整ph為6.8-7.2；btb培養基配方包括：檸檬酸三鈉1.60-2.00g；nano30.51-0.71g；kh2po40.50-1.50g；feso4·7h2o0.10-0.30g；mnso4·h2o?0.05-0.015g；溴百里酚藍0.5-1.5ml，蒸餾水1000ml，調整ph為6.6-7.0；以上培養基為液體培養基時，固體培養基在上述基礎上添加質量百分比為1-3％瓊脂粉。
4、優選的，所述hnm培養基包括hnm1培養基和hnm2培養基，所述dm培養基包括dm1培養基和dm2培養基；所述hnm1培養基配方為：(nh4)2so40.014g，檸檬酸三鈉0.053g，k2hpo4·3h2o?0.20g，mgso4·7h2o?0.05g，nacl?0.12g，feso4·7h2o?0.01g，mnso4·h2o?0.01g，cacl20.05g，蒸餾水1000ml，調整ph為7；所述hnm2培養基配方為：(nh4)2so40.47?g，檸檬酸三鈉1.80g，k2hpo4·3h2o?0.20g，mgso4·7h2o?0.05g，nacl?0.12g，feso4·7h2o?0.01g，mnso4·h2o?0.01g，cacl20.05g，蒸餾水1000ml，調整ph為7；所述dm1培養基配方為：kno30.72?g，檸檬酸三鈉1.80g，k2hpo4·3h2o?0.20g，mgso4·7h2o?0.05g，nacl?0.12g，feso4·7h2o?0.01g，mnso4·h2o?0.01g，cacl20.05g，蒸餾水1000ml，調整ph為7；所述dm2培養基配方為：nano20.5?g，檸檬酸三鈉1.80g，k2hpo4·3h2o?0.20g，mg?so4·7h2o?0.05g，nacl?0.12g，feso4·7h2o?0.01g，mnso4·h2o?0.01g，ca?cl20.05g，蒸餾水1000ml，調整ph為7。
5、本專利技術還提供所述培養基快篩寡營養hn-ad菌的方法，包括如下步驟：菌株富集：將泥樣與hnm1培養基混合，搖床28-32℃、160-200rpm富集70-74h，得富集培養液1；菌株初篩和保藏：取富集培養液1與hnm2培養基混合，搖床28-32℃、160-200rpm富集46-50h，得富集液2；將富集培養液2按照10-1-10-8進行濃度梯度稀釋，混勻，取稀釋濃度溶液涂布于btb固體培養基，26-30℃倒置培養，直至長出單個菌落；挑取btb固體平板上菌落周邊顏色變藍的、不同形態和大小的單菌落，在lb固體平板上劃線純化；挑取劃線平板上的單菌落接種至hnm2液體培養基中，搖床28-32℃、160-200rpm富集22-26h，得菌液，保藏；快速復篩：將菌液于lb平板劃線，26-30℃倒置培養，取平板上的單菌落接種至lb液體培養基中，搖床28-32℃、160-200rpm培養，菌株培養后，取菌液離心，收集沉淀洗滌，重懸，制備成od6000.8-1.2的菌懸液；將菌懸液分別接種于hnm2、dm1、dm2培養基中，設置空白對照，于28-32℃搖床中160-200rpm培養46-50h后檢測，經過上述三種培養基共同篩選出具有高效脫氮性能的目標hn-ad菌株。
6、優選的，菌株富集步驟中，所述泥樣與hnm1培養基的質量體積比為3-7g:180-220ml。
7、優選的，菌株初篩步驟中，富集培養液1與hnm2培養基的體積比為15-25ml:80-120ml。...
【技術保護點】
1.一種寡營養HN-AD菌的篩選培養基，其特征在于，包括HNM培養基、DM培養基和BTB培養基：
2.如權利要求1所述的篩選培養基，其特征在于，所述HNM培養基包括HNM1培養基和HNM2培養基，所述DM培養基包括DM1培養基和DM2培養基；
3.利用權利要求1或2所述培養基快篩寡營養HN-AD菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株富集步驟中，所述泥樣與HNM1培養基的質量體積比為3-7g:180-220mL。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株初篩步驟中，富集培養液1與HNM2培養基的體積比為15-25mL:80-120mL。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株初篩步驟中，根據菌株生長情況，取合適稀釋濃度溶液涂布于BTB固體培養基。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株初篩步驟中，在LB固體平板上使用四區劃線法進行純化2-4次。
8.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株保藏步驟包括：將0.5-1.5mL菌液與0.3-0.
9.如權利要求3所述的方法，其特征在于，快速復篩步驟中，將菌懸液按1-3％接種量分別接種于180-220μLHNM2、DM1、DM2培養基中。
10.如權利要求3所述的方法，其特征在于，快速復篩步驟中，檢測的方法包括：經HNM2培養的菌株定性檢測NH4+-N濃度，與空白對照組相比，黃色越淺表示NH4+-N濃度越低，脫NH4+-N效果越好；經DM2培養的菌株定性檢測NO2--N濃度，與空白對照組相比，紅色越淺表示NO2--N濃度越低，脫NO2--N效果越好；經DM1培養的菌株進行生長評估，肉眼觀察明顯變渾濁且OD600較大的，NO2--N檢測紅色較淺的作為選擇標準，表明脫NO3--N效果越好且NO2--N積累較少。
...【技術特征摘要】
1.一種寡營養hn-ad菌的篩選培養基，其特征在于，包括hnm培養基、dm培養基和btb培養基：
2.如權利要求1所述的篩選培養基，其特征在于，所述hnm培養基包括hnm1培養基和hnm2培養基，所述dm培養基包括dm1培養基和dm2培養基；
3.利用權利要求1或2所述培養基快篩寡營養hn-ad菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株富集步驟中，所述泥樣與hnm1培養基的質量體積比為3-7g:180-220ml。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株初篩步驟中，富集培養液1與hnm2培養基的體積比為15-25ml:80-120ml。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株初篩步驟中，根據菌株生長情況，取合適稀釋濃度溶液涂布于btb固體培養基。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，菌株初篩步驟中，在lb固體平...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李莉，李夢雅，張福圓，李大鵬，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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