【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學，更具體地說，它涉及一種基于rt-raa/crispr-cas13a/lfd檢測通用型禽流感的核酸分子組合物、試劑、試劑盒及應用。
技術介紹
1、禽流感病毒(aiv)近年來在世界范圍內流行，給養雞業造成了巨大的經濟損失。更重要的是，禽流感病毒能夠在哺乳動物之間進行跨物種傳播，對人類健康和安全構成潛在的重大威脅。
2、禽流感病毒(aiv)屬于甲型流感病毒，根據禽流感病毒血凝素(ha)和神經氨酸酶(na)蛋白抗原性的不同，可分為18種ha亞型(h1-h18)和11種na亞型(n1-n11)。理論上，它們可以組合成198種不同的亞型。這些亞型在病毒的致病性、傳播能力等方面可能存在差異。例如，h5n1、h7n9等亞型是對人類健康和家禽養殖業危害較大的高致病性禽流感亞型。
3、目前，核酸檢測技術是應用于禽流感病毒檢測比較廣泛的方法，主要是通過聚合酶鏈式反應(pcr)技術。首先提取樣本中的病毒核酸，然后利用特異性的引物對禽流感病毒的基因片段(如ha或na基因)進行擴增。如果樣本中存在禽流感病毒核酸，經過pcr擴增后，通過凝膠電泳、熒光定量pcr等方法可以檢測到相應的核酸片段。熒光定量pcr技術不僅可以檢測病毒核酸的存在，還可以對病毒核酸的含量進行定量分析，這對于評估病毒的感染程度和傳播風險等有重要意義。這種方法靈敏度高、特異性強，能檢測出低濃度的病毒，但需要專業的設備和技術人員，且檢測成本相對較高。
4、對于通用型禽流感病毒，目前還沒有一種同時具備靈敏度高、特異型好、且適用于臨床的
技術實現思路
1、為了解決現有技術存在的不足，本專利技術的目的是提供一種基于rt-raa/crispr-cas13a/lfd檢測通用型禽流感病毒的核酸分子組合物，利用本專利技術提供的核酸分子組合物可實現通用型禽流感病毒的可視化檢測，且檢測準確度高，用時短，特異性好、靈敏度高，為快速、簡便且準確地診斷通用型禽流感病毒提供了基礎，滿足臨床檢測的需求。
2、為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、一種基于rt-raa/crispr-cas13a/lfd檢測通用型禽流感病毒的核酸分子組合物，包括上游引物raa-m-f、下游引物raa-m-r和特異性crrna-m；
4、所述上游引物raa-m-f的序列為：5'-aagtgatcctctcgttattgccgcaagtat-3'(seqid?no:1)，
5、所述下游引物raa-m-r的序列為：5'-ctctgctgttcctgccggtactcttccctc-3'(seqid?no:2)，
6、所述特異性crrna-m的序列為：5'-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacaagaaaagacgaucaagaauccacaaua-3'(seq?id?no:3)。
7、本專利技術將rt-raa技術、crispr-cas13a系統和側向層析技術進行整合，建立crispr-lfd核酸檢測方法。在基因序列保守區域內設計特異性crispr-crrna和rt-raa引物組，用于通用型禽流感病毒檢測。將crispr檢測中的熒光信號轉變為直觀易讀的信號，通過側向層析試紙條實現結果的快速讀取，消除了對特殊設備依賴。該方法的檢測靈敏度為10copies/μl，且不與其它禽類疾病病原體發生交叉反應。在臨床樣品的檢測中，該技術同樣能在1h內完成檢測，且檢測結果與病毒分離鑒定及熒光定量pcr方法的符合率較高。
8、優選地，將上述核酸分子組合物制成用于檢測通用型禽流感病毒的試劑或試劑盒，含有上述核酸分子組合物的試劑或試劑盒均屬于本專利技術的保護范圍。
9、優選地，上述試劑盒還包含有lwacas13a蛋白和用于raa擴增的試劑。
10、本專利技術還提供一種利用前述的核酸分子組合物檢測通用型禽流感病毒的方法，其包括以下步驟：
11、s1：提取病毒核酸模板，用上游引物raa-m-f和下游引物raa-m-r組成的引物組對病毒核酸模板進行raa擴增；
12、s2：將raa擴增產物加入crispr-cas13a體系中進行孵育，所述crispr-cas13a體系包括特異性crrna-m；
13、s3：利用lfd對crispr-cas13a的孵育產物進行檢測。
14、優選地，步驟s1中的raa擴增體系包括：a?buffer29.4μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、核酸模板2～14.1μl、b?buffer2.5μl，dnase/rnase-free?wate補足至50μl。
15、優選地，步驟s1中的raa擴增體系在42℃下反應30min。
16、優選地，步驟s2中的crispr-cas13a體系包括：lwacas13a蛋白(15μg/ml)0.5μl、crrna(100μmol/l)0.2μl、探針(50μmol/l)1.28μl、t7?rna?polymerase?1.0μl、ntp?buffermix?0.2μl、murine?rnase?inhibitor
17、(40u/μl)1.0μl、10×cas13a?reaction?buffer?2.0μl、10×t7?rna?polymerasebuffer?2.0μl、cdna(100ng)0.6μl、dnase/rnase-free?water補足至20.0μl。
18、進一地，步驟s2中的孵育溫度為37℃，孵育時間為20min。
19、進一步地，利用lfd對crispr-cas13a孵育產物進行檢測時，lfd出現兩條紅帶為陽性，一條位于質控區，一條位于檢測區，陽性結果表明擴增產物中含有待檢測核酸片段；lfd的質控區出現一條紅帶，檢測區沒有紅帶，表示為陰性，陰性結果表明擴增產物中不含有檢測片段。
20、上述優選的反應條件可進一步提高通用型禽流感病毒的檢測效率。
21、本專利技術還提供了上述核酸分子組合物、試劑、試劑盒在非診斷性檢測禽通用型禽流感中的應用。
22、優選地，在禽類養殖環境監測應用方面，通過定期檢測環境樣本中的禽流感病毒核酸，來確定病毒是否在環境中存在，以此作為養殖場清潔和消毒措施是否有效的指標。如果檢測到病毒，養殖場可以及時加強消毒和隔離措施，防止病毒在禽類群體中傳播，預防禽流感的爆發。
23、優選地，在禽類交易市場的監測應用方面，從市場不同攤位采集樣本進行禽流感病毒檢測，一旦發現病毒，就可以對相關區域進行封閉和消毒處理，這種檢測主要是為了公共衛生和禽類貿易安全。
24、優選地，在候鳥遷徙路線的生態監測應用方面，在濕地等候鳥聚集區域采集水樣、土壤樣本和候鳥糞便樣本檢測禽流感病毒。這是因為候鳥是禽流感病毒的天然宿主之一，它們在遷徙過程中可能會傳播病毒。這種監測的目的是了解禽流感病毒在自然生態環本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于RT-RAA/CRISPR-Cas13a/LFD檢測通用型禽流感病毒的核酸分子組合物，其特征在于，包括上游引物RAA-M-F、下游引物RAA-M-R和特異性crRNA-M；所述上游引物RAA-M-F的序列如SEQ?IDNo:1所示，所述下游引物RAA-M-R的序列如SEQ?ID?No:2所示，所述特異性crRNA-M的序列如SEQ?ID?No:3所示。
2.一種用于檢測通用型禽流感的試劑，其特征在于，包含權利要求1所述的核酸分子組合物。
3.一種用于檢測通用型禽流感的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的核酸分子組合物。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含LwaCas13a蛋白和用于RAA擴增的試劑。
5.一種利用權利要求1所述的核酸分子組合物檢測通用型禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：
6.權利要求1所述的核酸分子組合物在非診斷性檢測禽通用型禽流感中的應用。
7.權利要求2所述的試劑在非診斷性檢測禽通用型禽流感中的應用。
8.權利要求3或4所述的
...【技術特征摘要】
1.一種基于rt-raa/crispr-cas13a/lfd檢測通用型禽流感病毒的核酸分子組合物，其特征在于，包括上游引物raa-m-f、下游引物raa-m-r和特異性crrna-m；所述上游引物raa-m-f的序列如seq?idno:1所示，所述下游引物raa-m-r的序列如seq?id?no:2所示，所述特異性crrna-m的序列如seq?id?no:3所示。
2.一種用于檢測通用型禽流感的試劑，其特征在于，包含權利要求1所述的核酸分子組合物。
3.一種用于檢測通用型禽流感的試劑盒，其特...
【專利技術屬性】
技術研發人員：賈偉新，楊芷翊，楊宇佳，張心葵，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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