【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于海水魚類生長發(fā)育與細胞培養(yǎng)，具體涉及一種海水魚類成肌細胞體外增殖方法。
技術介紹
1、豹紋鰓棘鱸（plectropomus?leopardus）俗稱東星斑，隸屬于鱸形目、鮨科、石斑魚亞科、鰓棘鱸屬、藍點鰓棘鱸種。主要棲息于印度洋—太平洋的熱帶或者亞熱帶水域中，因其肉質鮮美和極高的應用價值深受市場大眾的追捧。這種魚是世界上最重要的漁業(yè)資源之一，豹紋鰓棘鱸作為整個印度-西太平洋地區(qū)的支柱性商品，具有重要商業(yè)價值?；铘~的零售價從每公斤50美元到75美元不等。這種高利潤導致了豹紋鰓棘鱸巨大的市場需求，且年總收獲量年年增加。但由于近年來珊瑚礁的破壞和違法過度捕撈，導致野生豹紋鰓棘鱸的數(shù)量急劇減少，所以亟待以人工大規(guī)模養(yǎng)殖來填補市場需求的大量缺口。目前，由于豹紋鰓棘鱸的生長發(fā)育周期長，人工養(yǎng)殖的豹紋鰓棘鱸需要發(fā)育兩到三年才能達到上市的標準，而且普遍存在生長速度緩慢和個體生長速度差異巨大的問題，從而導致了豹紋鰓棘鱸的存活率降低和養(yǎng)殖成本升高，嚴重影響了水產養(yǎng)殖產業(yè)的健康發(fā)展。生長是一種軀體發(fā)育進程，反映了一個有機體在飼料攝取與利用之間的平衡，魚類的生長速度是水產養(yǎng)殖產業(yè)發(fā)展的關鍵因素，通過提高骨骼肌的生長速度，以縮短養(yǎng)殖年限對于降低養(yǎng)殖的風險和成本的投入具有重要的指導意義。
2、目前，不同于胚胎細胞培育，魚類肌肉細胞的分離和體外培養(yǎng)的幾種方法均尚不完善，無論是成功率還是效率都有待大幅提升。前人通過幼年大菱鲆背部肌肉為原始組織，采用組織貼壁培養(yǎng)的方法，以l-15培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，成功獲得了可以長期培養(yǎng)且生
3、胰島素樣生長因子（igf，insulin?like?growth?factor）家族成員之一，是一類多功能細胞調控因子，大部分igf在肝臟內合成，主要存在于血液循環(huán)中。類胰島素生長因子-2（igf2）是igf家族成員之一，是一種多功能細胞增殖的關鍵調控因子，在體細胞的分化增殖、胚胎的生長發(fā)育以及腫瘤細胞增殖中具有重要的促進作用。已有研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物igf2可以通過對mapk和pi3k/akt信號通路的調控進而干預哺乳動物細胞增殖分化。但igf2是否對海水魚類細胞體外增殖產生影響，且不同濃度的igf2在細胞體外增殖培養(yǎng)過程中發(fā)揮的功能均未見報道。
4、因此，有必要建立規(guī)范的海水魚類成肌細胞體外增殖的方法，以期解決現(xiàn)有技術無法進行成肌細胞體外增殖、細胞存活率低或增殖細胞不穩(wěn)定等問題，從而獲得具有較高活性的成肌細胞，為探究成肌細胞自身功能、基因調控機制提供原料，并為進一步探究海水魚類成肌細胞對期生長速度的影響提供離體驗證實驗前提條件。同時，也為海水魚類的良種繁育奠定基礎。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的目的是為了建立規(guī)范的海水成肌細胞體外增殖方法，為解決該技術問題：
2、本專利技術第一方面提供一種海水魚類成肌細胞體外增殖用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基以基礎培養(yǎng)基為背景培養(yǎng)基；培養(yǎng)基包含終濃度為20-70?ng/ml、70-90?ng/ml、90-110?ng/ml、110-120?ng/ml、120-150?ng/ml或150-200?ng/ml的igf2蛋白；igf2蛋白為豹紋鰓棘鱸來源。
3、進一步的，海水魚類為鱸形目魚類；鱸形目魚類為鰭科魚類；鰭科魚類為豹紋鰓棘鱸、駝背鱸、棕點石斑魚、赤點石斑魚、云紋石斑魚或寶石石斑魚。
4、進一步的，基礎培養(yǎng)基包括l-15培養(yǎng)基、胎牛血清、naee、1×雙抗和β-巰基乙醇；l-15培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基體積的62-63%、63-64%或64-65%；胎牛血清為基礎培養(yǎng)基體積的14.0-14.5%、14.5-15.0%或15.0-15.5%；naee為基礎培養(yǎng)基體積的0.8-0.9%、0.9-1.0%或1.0-1.1%；1×雙抗的包括：100?iu/ml青霉素、100?μg/ml鏈霉素；β-巰基乙醇的終濃度為0.04-0.045?mm、0.045-0.050?mm或0.050-0.055?mm。
5、本專利技術第二方面提供一種海水魚類成肌細胞體外增殖方法，海水魚類成肌細胞體外增殖方法應用上述培養(yǎng)基，海水魚類成肌細胞體外增殖方法包括以下步驟：步驟a：對豹紋鰓棘鱸的骨骼肌組織進行預處理，得到預處理肌肉組織；步驟b：對預處理肌肉組織進行原代培養(yǎng)得到原代細胞；步驟c：對原代細胞進行傳代培養(yǎng)得到傳代細胞；步驟d：利用igf2培養(yǎng)基對傳代細胞進行培養(yǎng)得到豹紋鰓棘鱸體外增殖的成肌細胞。
6、進一步的，步驟a具體為：利用健康的2月齡、3月齡或4月齡的豹紋鰓棘鱸進行魚體表面消毒，在無菌條件下取下豹紋鰓棘鱸的背部第二肌節(jié)的骨骼肌組織即為豹紋鰓棘鱸骨骼肌組織；將豹紋鰓棘鱸骨骼肌組織置于含有5×雙抗的pbs緩沖液中浸泡清洗三次，每次清洗時間為5?min；將豹紋鰓棘鱸骨骼肌組織剪碎至2?mm2大小的組織塊，加入含有2×雙抗的pbs緩沖液洗去血液，剔除豹紋鰓棘鱸骨骼肌組織的體膚薄膜和殘留的血液，得到預處理肌肉組織。
7、進一步的，含有5×雙抗的pbs緩沖液包括：500?iu/ml青霉素和500?μg/ml鏈霉素；含有2×雙抗的pbs緩沖液包括：200?iu/ml青霉素和200?μg/ml鏈霉素。
8、進一步的，步驟b具體為：對預處理肌肉組織接種至6孔板中，利用基礎培養(yǎng)基對預處理肌肉組織進行原代培養(yǎng)，每2天更換一次基礎培養(yǎng)基，28℃條件下正置培養(yǎng)得到原代細胞。
9、進一步的，步驟c具體為：當原代細胞的鋪板率達到70-80%時，對原代細胞利用胰蛋白酶進行消化反應得到原代成肌細胞；對原代成肌細胞利用基礎培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)得到傳代細胞；胰蛋白酶的濃度為0.0625%；消化反應的溫度為25-26℃、26-27℃或27-28℃；消化反應的時間為5.0-5.5?min、5.5-6.0?min或6.0-6.5?min。
10、進一步的，步驟d具體為：當傳代細胞處于對數(shù)生長周期時，利用igf2培養(yǎng)基對傳代細胞進行增殖培養(yǎng)得到豹紋鰓棘鱸體外增殖的成肌細胞；增殖培養(yǎng)的溫度為28℃，增殖培養(yǎng)的時間為12-20?h、20-40?h、40-60?h、60-80?h或80-100?h。
11、進一步的，豹紋鰓棘鱸體外增殖的成肌細胞的細胞數(shù)量達到30000個；豹紋鰓棘鱸體外增殖的成肌細胞的增殖率為87%。
12、本專利技術通過利用豹紋鰓棘鱸骨骼肌肉組織通過胰酶消化法分離進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)得到豹紋鰓棘鱸成肌細胞，再通過培養(yǎng)基中添加豹紋鰓棘鱸來源的igf2蛋白成功進行豹紋鰓棘鱸成肌細胞的體外增殖，可提供大量的豹紋鰓棘鱸來源的成肌細胞，且細胞能維持良好的生長狀態(tài)。此外，利用本專利技術濃度為100?ng/ml豹紋鰓棘鱸來源的igf2蛋白培養(yǎng)的成肌細胞體外本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種海水魚類成肌細胞體外增殖用培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基以基礎培養(yǎng)基為背景培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基包含終濃度為20-70?ng/mL、70-90?ng/mL、90-110?ng/mL、110-120?ng/mL、120-150?ng/mL或150-200?ng/mL的IGF2蛋白；所述IGF2蛋白為豹紋鰓棘鱸來源。
2.根據(jù)權利要求1所述的海水魚類成肌細胞體外增殖用培養(yǎng)基，其特征在于，海水魚類為鱸形目魚類；所述鱸形目魚類為鰭科魚類；所述鰭科魚類為豹紋鰓棘鱸、駝背鱸、棕點石斑魚、赤點石斑魚、云紋石斑魚或寶石石斑魚。
3.根據(jù)權利要求1所述的海水魚類成肌細胞體外增殖用培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎培養(yǎng)基包括L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、NAEE、1×雙抗和β-巰基乙醇；
4.一種海水魚類成肌細胞體外增殖方法，所述海水魚類成肌細胞體外增殖方法應用如權利要求1-3任意一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述海水魚類成肌細胞體外增殖方法包括以下步驟：
5.根據(jù)權利要求4所述的海水魚類成肌細胞體外增殖方法，其特征在于，所述步驟A具體為：
6.
7.根據(jù)權利要求4所述的海水魚類成肌細胞體外增殖方法，其特征在于，
8.根據(jù)權利要求4所述的海水魚類成肌細胞體外增殖方法，其特征在于，
9.根據(jù)權利要求4所述的海水魚類成肌細胞體外增殖方法，其特征在于，
10.根據(jù)權利要求9所述的海水魚類成肌細胞體外增殖方法，其特征在于，所述豹紋鰓棘鱸體外增殖的成肌細胞的細胞數(shù)量達到30000個；所述豹紋鰓棘鱸體外增殖的成肌細胞的增值率為87%。
...【技術特征摘要】
1.一種海水魚類成肌細胞體外增殖用培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基以基礎培養(yǎng)基為背景培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基包含終濃度為20-70?ng/ml、70-90?ng/ml、90-110?ng/ml、110-120?ng/ml、120-150?ng/ml或150-200?ng/ml的igf2蛋白；所述igf2蛋白為豹紋鰓棘鱸來源。
2.根據(jù)權利要求1所述的海水魚類成肌細胞體外增殖用培養(yǎng)基，其特征在于，海水魚類為鱸形目魚類；所述鱸形目魚類為鰭科魚類；所述鰭科魚類為豹紋鰓棘鱸、駝背鱸、棕點石斑魚、赤點石斑魚、云紋石斑魚或寶石石斑魚。
3.根據(jù)權利要求1所述的海水魚類成肌細胞體外增殖用培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎培養(yǎng)基包括l-15培養(yǎng)基、胎牛血清、naee、1×雙抗和β-巰基乙醇；
4.一種海水魚類成肌細胞體外增殖方法...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：汪波，孫薏雯，胡景杰，金超凡，陳建美，尹晨霖，湯海占，包振民，
申請(專利權)人：中國海洋大學三亞海洋研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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