【技術實現步驟摘要】
本專利技術具體涉及一種牛or2ad1基因上游的20bp?indel多態性的快速檢測方法，以及檢測方法的應用，屬于分子遺傳學領域。
技術介紹
1、脊椎動物的嗅覺在許多方面都起著關鍵作用，例如定位獵物或食物、交配行為、避開捕食者和社會交流。嗅覺主要是由嗅覺受體(olfactory?receptor，or)捕捉揮發性氣味物質，產生神經沖動，經嗅神經傳至大腦皮層產生嗅覺。or基因是由多基因超家族編碼，其數量龐大，在哺乳動物中僅次于免疫系統編碼基因，占哺乳動物基因組基因總量的3％～5％。在發育過程中每個嗅覺神經元“選擇”只產生1種or，一旦嗅覺神經元識別功能性受體，就會停止產生其他的or。or基因編碼區長約1kb，且其內無內含子。在牛上，嗅覺受體2家族ad亞家族成員1(olfactory?receptor?family?2subfamily?ad?member?1，or2ad1)基因位于23號染色體上，包含1個外顯子，已有研究顯示or2a2基因cnv與牛的剩余采食量和干物質采食量等表型相關。本專利技術檢測了or2ad1基因上游20bp?indel多態性在不同牛品種中的分布，通過與夏南牛群體體重、體尺性狀進行關聯分析，為篩選出純合高品質的地方牛群體以及與牛生長性狀密切相關的分子遺傳標記奠定基礎。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法及其應用。
2、1、為了實現以上目的，本專利技術所采用的技術方案是：
4、上游引物p-f：5’-ggcaccaaaaacacattgcac-3’；
5、下游引物p-r：5’-tcctccgctttttcctgctt-3’。
6、(2)以包含or2ad1基因的待測牛全基因組dna為模板，以引物對p為引物同時pcr擴增牛or2ad1基因上游-611～-591在內的20bp的序列，得到擴增產物；
7、(3)對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測牛or2ad1基因上游20bp?indel的核苷酸多態性，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定牛or2ad1基因的不同基因型。當在包含20bp?indel插入時，擴增產物為一條帶，條帶大小為124bp，命名為ii基因型；當發生20bp缺失時，擴增產物為一條帶，條帶大小為104bp，命名為dd基因型；當該位點為雜合的個體時，擴增產物為兩條帶，條帶大小分別為124bp和104bp，命名為id基因型。
8、(4)根據權利要求1所述的一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，所述20bp?indel位點位于牛or2ad1基因上游的-611～-591之間，其中牛基因序列的登錄號nc_037350.1。
9、(5)根據權利要求1所述的一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，擴增反應體系為：2×taq?pcr?mastermix?5.00μl，ddh2o?3.00μl，p-f0.5μl，p-r?0.5μl，dna模板1.0μl。pcr擴增反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性15s，53℃退火15s，72℃延伸15s，30個循環；72℃延伸5min；4℃保存。
10、(6)根據權利要求1所述的一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳檢測所用的瓊脂的質量分數為3.0％。
11、(7)根據權利要求1所述的檢測牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于：所述步驟5中瓊脂糖凝膠電泳的電壓為120v，電泳時間為40min。
12、2、本專利技術所采用的技術方案還在于提供一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法的應用，所述的檢測方法可用于牛的輔助選擇和分子育種。通過將基因型與夏南牛的體重、體尺性狀進行關聯分析，確定基因型與性狀的對應關系，用于牛的分子育種。
13、(1)所述性狀為生長性狀，主要包括體重、體尺性狀。
14、(2)牛or2ad1基因20bp?indel分別位于牛or2ad1基因擴增目的片段124bp的51～70位置上，ii基因型插入了“aaaattaatacaagaaaaaa”20bp?indel序列，dd基因型相應位置缺失了的上述序列。在夏南牛群體以及其他不同品種牛中，or2ad1基因上游20bp?indel的不同基因型分布如下：
15、表1or2ad1基因20bp?indel在不同品種牛中基因型分布
16、
17、(3)or2ad1基因20bp?indel多態性與夏南牛群體的體重、體尺性狀的關聯性分析表明多態性與牛的部分重要生長性狀有顯著關聯，d等位基因即共計20bp的缺失利于牛的生長，dd基因型為優勢基因型。
18、(4)本專利技術采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測pcr產物的結果，是一種在dna水平上篩查和檢測與牛生長性狀密切相關的分子遺傳標記。本專利技術建立的分子生物學方法操作簡單、成本低、周期短，大大提高了該位點基因型判定的準確性，不需要特殊的儀器，易推廣普及。試驗表明本方法能有效地判定牛or2ad1基因上游兩個indel多態性的基因型，可以用于牛的經濟性狀位點的分子標記輔助選擇，進而建立一個純合高產的地方牛種群。
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1.一種牛OR2AD1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法及其應用，其特征在于，主要包括以步驟：
2.根據權利要求1所述的一種牛OR2AD1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，所述20bp?indel位點位于牛OR2AD1基因上游的-611～-591，其中牛基因序列的登錄號NC_037350.1。
3.根據權利要求1所述的一種牛OR2AD1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，擴增反應體系為：2×Taq?PCRMasterMix?5.00μL，ddH2O?3.00μL，P-F?0.5μL，P-R?0.5μL，DNA模板1.0μL。PCR擴增反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性15s，53℃退火15s，72℃延伸15s，38個循環；72℃延伸10min；4℃保存。
4.根據權利要求1所述的一種牛OR2AD1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳檢測所用的瓊脂的質量分數為3.0％。
5.根據權利要求1所述的檢測牛OR2AD1基
6.根據權利要求1所述的檢測牛OR2AD1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，通過將基因型與牛的體重、體尺性狀進行關聯性分析，其中所述性狀為生長性狀和體尺性狀。所述的檢測方法可用于牛的輔助選擇和分子育種。
...【技術特征摘要】
1.一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法及其應用，其特征在于，主要包括以步驟：
2.根據權利要求1所述的一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，所述20bp?indel位點位于牛or2ad1基因上游的-611～-591，其中牛基因序列的登錄號nc_037350.1。
3.根據權利要求1所述的一種牛or2ad1基因上游20bp?indel多態性的快速檢測方法，其特征在于，擴增反應體系為：2×taq?pcrmastermix?5.00μl，ddh2o?3.00μl，p-f?0.5μl，p-r?0.5μl，dna模板1.0μl。pcr擴增反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性15s...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王香南，張子敬，王二耀，施巧婷，閆祥洲，劉賢，黃永震，張家慶，袁林，柴亞楠，劉國輝，
申請(專利權)人：河南省農業科學院畜牧研究所，
類型：發明
國別省市：
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