【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，涉及基因檢測試劑盒，具體涉及一種用于人乳頭瘤病毒核酸檢測的核酸組合物、試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、人乳頭瘤病毒(human?papilloma?virus，hpv)是一類雙鏈環(huán)狀dna病毒，主要感染皮膚和粘膜組織，可引起疣、良性腫瘤和癌癥。hpv病毒顆粒直徑約為55nm，核殼呈20面體對稱，有72個殼粒。hpv是小型dna病毒，無包膜，雙鏈閉環(huán)dna基因組，7.2-8kb。基因組分三個功能區(qū)：①早期區(qū)(e)：約4.5kb，含e1，e2，e4-e7共6個亞區(qū)：②晚期區(qū)(l)，約2.5kb含l1l2兩個亞區(qū)：長調(diào)控區(qū)(lcr)，位于l區(qū)未端與e區(qū)起始端之間，一般為800-900bp。e1參與病毒復(fù)制，其編碼蛋白具有atp依賴性解旋酶活性：e2參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，e3編碼蛋白是主要的病毒轉(zhuǎn)錄因子；e4編碼晚期胞質(zhì)蛋白，與病毒成熟有關(guān)：e5具有較弱的轉(zhuǎn)化活性：e6、e7主要與細胞轉(zhuǎn)化及致瘤性有關(guān)：l區(qū)編碼兩種蛋白，l1是主要的種特異性抗原，l2是型特異性抗原，l1或l1/l2在真核細胞中能組裝成病毒樣顆粒：lcr也稱urr，含dna復(fù)制、表達調(diào)控元件。病毒基因的表達由病毒和宿主細胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括e2，lcr及細胞內(nèi)反式調(diào)節(jié)因子，它們的改變可使轉(zhuǎn)化蛋白過表達而致瘤。據(jù)國際人乳頭瘤病毒參考中心的最新統(tǒng)計，目前共發(fā)現(xiàn)超過200種hpv基因型。根據(jù)各亞型的致癌潛力，通常將hpv分為高危型和低危型兩大類。高危型hpv感染可引起男女外生殖器癌、宮頸癌等，幾乎全部的宮頸鱗癌及超過85％的宮頸腺癌均由hpv感染所至。大量研究證實
2、目前對于hpv的檢測主要是基于dna水平的分子生物學(xué)方法，這是目前最靈敏的檢測手段，為檢測低水平的病毒感染提供了有效手段。感染的hpv的亞型、持續(xù)的時間及hpv的含量影響了癌變的過程，基于dna水平的方法主要有核酸雜交檢測，聚合酶鏈式反應(yīng)法等。基于pcr技術(shù)同樣也衍生出許多其他應(yīng)用于hpv檢測的實驗方法，例如：通用引物pcr，型特異引物pcr，限制性片段長度多態(tài)性分析，反向雜交等等。以型特異引物pcr來說，這是一種選擇型特異引物對樣本dna擴增的檢測方法，利用這種方法進行檢測時，必須同時進行多個pcr反應(yīng)，是一種費時費力，局限性非常大的檢測方法。而通用引物pcr是針對hpv各個亞型的保守序列設(shè)計引物，一般是針對l1區(qū)進行擴增。傳統(tǒng)的hpv檢測主要是通過形態(tài)學(xué)方法與免疫學(xué)方法相結(jié)合的方法，但傳統(tǒng)的檢測方法其特異性和靈敏度不夠理想。巴氏涂片是半個世紀來普遍使用的基本篩查方法，但是近年來巴氏涂片在宮頸癌和癌前病變診斷的過程中出現(xiàn)的問題越來越明顯。雖然為了改進巴氏涂片法，人們又推出了薄層液基技術(shù)，該技術(shù)大大改進了實驗操作，降低了假陽性等問題，但是高昂的操作費用使這種技術(shù)依然無法成為主流的操作技術(shù)。基因芯片技術(shù)是一種依賴于固相載體的技術(shù)，雖然這種技術(shù)有眾多的優(yōu)點，但這種方法主要運用于研究宮頸疾病和hpv各亞型的關(guān)系中，無法在臨床檢測中大規(guī)模運用與推廣。
3、基于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的實時熒光定量pcr方法是目前hpv-dna檢測使用最廣泛的一種技術(shù)。該技術(shù)是指pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；pcr擴增時，taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步。
4、與普通pcr相比，實時熒光pcr實驗結(jié)果更直觀，更實時。實時熒光pcr是通過在pcr體系中摻入熒光基團，依靠熒光信號的積累進行檢測，實驗結(jié)果以標準曲線和ct值實現(xiàn)絕對定量。有研究比較了第二代雜交捕獲法和熒光pcr兩種監(jiān)測方法在人乳頭瘤病毒臨床檢測中的應(yīng)用，根據(jù)實驗結(jié)果來看，兩種不同的檢測方法與高危型宮頸癌病變均具有比較好的相關(guān)性，但是熒光pcr在靈敏度和特異性上更具有優(yōu)勢，而且在研究中實時熒光pcr的總陽性檢出率也更高，這提示熒光pcr可以作為一種有效的檢測方法進行臨床檢測，為人乳頭瘤病毒的有效檢測提供了依據(jù)。多重?zé)晒鈖cr則是由于熒光基團間的差異，可以同時擴增兩對或兩對以上的目的基因。該法將普通pcr的高靈敏性、dna雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高準確性有機結(jié)合，克服了傳統(tǒng)pcr在許多方面的缺點和局限性，實時pcr閉管操作，可有效消除在核酸擴增中由于汽溶膠所致的交叉污染，對dna模板可以定性或定量的準確性與特異性都有很大提高。多重?zé)晒鈖cr已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因檢測、性病檢測、基因表達異常的遺傳病檢測等多個領(lǐng)域。
5、現(xiàn)有技術(shù)cn104195247b應(yīng)用多重?zé)晒鈖cr技術(shù)實現(xiàn)了在同一管擴增體系中檢測18種hpv基因型，同時三色高危hpv熒光檢測試劑盒在同時檢測15種常見高風(fēng)險hpv基因型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)時，還可檢測三種少見高風(fēng)險hpv基因型(26、53、73)。四色高危hpv熒光檢測試劑盒在同時檢測13種常見高風(fēng)險hpv基因型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)和三種少見高風(fēng)險hpv基因型(26、53、73)，同時還能具體分型高風(fēng)險hpv基因型16型和18型。該專利技術(shù)還通過加入ung酶防污染,使得本專利技術(shù)試劑盒的靈敏度更高。該技術(shù)探針數(shù)目多少，抗干擾能力差。
6、現(xiàn)有技術(shù)cn110904278b公開了一種13型高危hpv多重?zé)晒鈾z測試劑盒，包括熱啟動taq酶系統(tǒng)、dutp?ung防污染體系，加尾引物、通用引物、熒光探針、陰性對照和陽性對照，熒光探針為hpv特異性探針；該專利技術(shù)的試劑盒適用于定性檢測宮頸脫落細胞和生殖泌尿道分泌物樣本中13種可引起宮頸癌的高風(fēng)險hpv基因型，并對16和18兩種基因型進行分型；該試劑盒應(yīng)用同源加尾系統(tǒng)降低了多個引物之間的干擾，實現(xiàn)了在同一管熒光pcr擴增體系中檢測13種hpv基因型。該專利技術(shù)同時檢測的hpv基因型個數(shù)少，且引物探針設(shè)計比較繁瑣。
7、熒光定量pcr技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對hpv的檢測，但目前常見的該類方法檢測高危型hpv時往往針對每種hpv亞型設(shè)計一種探針，多種高危型hpv亞型檢測則需要多種探針，探針合成成本高，且不同探針間容易造成干擾，造成檢測特異性差。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)針對現(xiàn)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種核酸組合物，其特征在于，所述核酸組合物包括對應(yīng)HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82這18個基因型的探針以及對應(yīng)該18個基因型的正向引物和反向引物，所述探針的序列為SEQ?ID?NO.1-5所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述正向引物的序列為SEQ?IDNO.6-22所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述反向引物的序列為SEQ?IDNO.23-37所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述探針的5’端標記有熒光基團，所述熒光基團為Cyan500、FAM、VIC、Cy3、JOE、TAMRA、Texas?Red、ROX、Cy5、Cy5.5、TET、HEX或NED中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述探針的3’端標記有淬滅基團，所述淬滅基團為MGB
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5任一項所述的核酸組合物，其特征在于，所述SEQ?ID?NO.1、SEQID?NO.2和SEQ?ID?NO.3-5對應(yīng)的探針的熒光基團不同。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸組合物，其特征在于，所述SEQ?ID?NO.1對應(yīng)探針的5’端為CY5熒光基團，3’端為BHQ2淬滅基團；所述SEQ?ID?NO.2對應(yīng)探針的5’端為ROX熒光基團，3’端為BHQ2淬滅基團；所述SEQ?ID?NO.3-5對應(yīng)探針的5’端為FAM熒光基團，3’端為MGB淬滅基團。
8.一種用于人乳頭狀瘤病毒核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-7任一項所述的核酸組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括擴增反應(yīng)液、陰性對照、陽性對照和質(zhì)控內(nèi)參。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述擴增反應(yīng)液中包括反應(yīng)緩沖液、熱啟動Taq酶、dNTPs、dUTP和UNG酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照包括無菌去離子水、TE緩沖液或者權(quán)利要求10中所述的反應(yīng)緩沖液。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照包括含有試劑盒檢測范圍內(nèi)的18個HPV亞型基因的質(zhì)粒或DNA片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述質(zhì)控內(nèi)參包括與β-肌動蛋白基因、微管蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因或核糖核酸酶P30基因互補配對的特異性探針以及對應(yīng)的正向引物和反向引物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性探針的5’端標記有熒光基團，所述熒光基團為Cyan500、FAM、VIC、Cy3、JOE、TAMRA、Texas?Red、ROX、Cy5、Cy5.5、TET、HEX或NED中的任意一種；所述特異性探針的3’端標記有淬滅基團，所述淬滅基團為MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL或Eclipse中的任意一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求13-14任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性探針的5’端熒光基團與權(quán)利要求1所述的探針的5’端熒光基團不同。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述質(zhì)控內(nèi)參包含與核糖核酸酶P30基因互補配對的序列如SEQ?ID?NO.38所示的特異性探針、序列如SEQ?ID?NO.39所示的正向引物和序列如SEQ?ID?NO.40所示的反向引物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性探針的5’端為VIC熒光基團，3’端為BHQ1淬滅基團。
18.權(quán)利要求1-7任一項所述的核酸組合物在檢測高危型人乳頭瘤病毒中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為非疾病診斷或治療應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種核酸組合物，其特征在于，所述核酸組合物包括對應(yīng)hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73、hpv82這18個基因型的探針以及對應(yīng)該18個基因型的正向引物和反向引物，所述探針的序列為seq?id?no.1-5所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述正向引物的序列為seq?idno.6-22所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述反向引物的序列為seq?idno.23-37所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述探針的5’端標記有熒光基團，所述熒光基團為cyan500、fam、vic、cy3、joe、tamra、texas?red、rox、cy5、cy5.5、tet、hex或ned中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述探針的3’端標記有淬滅基團，所述淬滅基團為mgb、tamra、bhq1、bhq2、bhq3、nfq、dabcyl或eclipse中的任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5任一項所述的核酸組合物，其特征在于，所述seq?id?no.1、seqid?no.2和seq?id?no.3-5對應(yīng)的探針的熒光基團不同。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸組合物，其特征在于，所述seq?id?no.1對應(yīng)探針的5’端為cy5熒光基團，3’端為bhq2淬滅基團；所述seq?id?no.2對應(yīng)探針的5’端為rox熒光基團，3’端為bhq2淬滅基團；所述seq?id?no.3-5對應(yīng)探針的5’端為fam熒光基團，3’端為mgb淬滅基團。
8.一種用于人乳頭狀瘤病毒核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-7任一項所述的核酸組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂訥男，章文羿，何玉貴，黃清瑞，李晶，王蕾，趙長有，李小芳，
申請(專利權(quán))人：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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