【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程和生物。具體地，本專利技術涉及一種促進絲狀真菌例如毀絲霉的胞外蛋白生產水平的方法，具體涉及毀絲霉的遺傳改造。
技術介紹
1、絲狀真菌蛋白質表達分泌系統發展潛力巨大、專利前景廣闊，它作為細胞工廠可高效表達分泌胞外蛋白，生產有價值的產品(例如工業蛋白質和有機酸等)。嗜熱毀絲霉(myceliophthora?thermophila)是一種嗜熱絲狀真菌，能夠分泌多種木質纖維素水解酶，具有高溫發酵，生長代謝速率快等特點，在工業生產中具有很大的應用潛力。
2、但是絲狀真菌天然菌株的蛋白質生產水平較低，需要進行多次的誘變育種或者多輪的分子遺傳改造，提高蛋白質的表達分泌水平，才能獲得可用于蛋白質生產的工業菌種。隨著絲狀真菌基因組學技術和基因組編輯技術的迅速發展和成熟，通過分子遺傳學和代謝工程技術獲得了性狀改良的工業生產菌株，然而可用于基因工程改造的靶標基因數目是非常有限的。專利cn110205334b提供了一種在嗜熱毀絲霉中通過改造調節因子來達到提高纖維素酶表達水平的方法。但是絲狀真菌蛋白質表達分泌的分子機制是非常復制，參與木質纖維素水解酶基因表達分泌的途徑的基因眾多，尚未解析清晰。
3、但是，高產菌株不僅要在表達水平上提高基因的rna豐度，還需要我們進一步了解蛋白在分泌過程中的效應，減輕甚至消除分泌途徑的瓶頸，進一步提高絲狀真菌蛋白生產水平。因此，有必要鑒定這分泌途徑中關鍵調控因子，并利用基因編輯技術獲得纖維素酶生產水平顯著提高的重組菌株，從而開發能夠提高纖維素酶等蛋白質生產的技術和方法，具有創新
技術實現思路
1、本專利技術人經過廣泛而深入的研究，目的在于提供一種能夠提高絲狀真菌產纖維素酶生產能力和蛋白分泌水平的菌種改造方法，是通過遺傳改造絲狀真菌蛋白分泌途徑相關基因來提高絲狀真菌纖維素酶產量和蛋白分泌水平。本專利技術通過crispr-cas9基因組編輯技術對嗜熱毀絲霉菌株基因mycth_2300902和mycth_2306768進行敲除編輯，獲得了基因mycth_2300902和mycth_2306768缺失重組菌株，該重組菌株能夠顯著提升蛋白的分泌水平，顯著提高纖維素酶、半纖維素酶和糖化酶的生產能力和酶活水平。
2、為達到此目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、本專利技術第一方面提供一種通過遺傳改造技術獲得基因mycth_2300902和mycth_2306768的缺失突變菌株的方法，是通過crispr-cas9基因組編輯技術對嗜熱毀絲霉菌株進行基因敲除獲得的基因編輯突變菌。所述的構建方法，包括如下步驟：構建2個針對靶向基因mycth_2300902和mycth_2306768的引導rna(sgrna)表達元件，其核苷酸序列分別如seqid?no.5所示(mycth_2300902-sgrna)和seq?id?no.6所示(mycth_2306768-sgrna)；構建含有g418抗性標記的基因mycth_2300902和mycth_2306768的同源供體dna序列，其核苷酸序列如seq?id?no.7所示(donor-mycth_2300902)和seq?id?no.8所示(donor-mycth_2306768)。將cas9蛋白的表達框，mycth_2300902-sgrna以及供體dna?donor-mycth_2300902；將cas9蛋白的表達框，mycth_2306768-sgrna以及供體dna?donor-mycth_2306768分別共轉化進入宿主菌株的原生質體細胞后，通過同源重組能獲得基因編輯突變株。
4、另一方面，本專利技術提供一種用于生產纖維素酶、糖化酶、或其它蛋白的重組菌株，其與出發菌株相比，獲得更強的纖維素酶、糖化酶或其它蛋白的分泌能力和降解纖維素和淀粉的能力；所述的重組菌株為命名為δmycth_2300902和δmycth_2306768的基因突變菌株，其是敲除了基因mycth_2300902和mycth_2306768的毀絲霉菌株。更具體，本專利技術提供一種生產分泌纖維素酶、糖化酶能力增強的嗜熱毀絲霉重組菌，其是通過本專利技術的基因編輯方法對嗜熱毀絲霉基因mycth_2300902和mycth_2306768進行基因編輯獲得基因mycth_2300902和mycth_2306768缺失突變的嗜熱毀絲霉重組菌。
5、其中，所述宿主細胞為毀絲霉。更具體的實施方式中，所述宿主細胞選自但不限于毀絲霉屬，最優選為嗜熱毀絲霉。
6、在本專利技術中，對所用術語的含義作一說明。
7、“重組”被用于指代菌株、細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該菌株、細胞、核酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。例如，重組菌株是表達在天然(非重組)形式的該菌株中不曾發現的基因，或者表達天然基因。
8、“宿主菌株”或“宿主細胞”，是指表達載體或dna構建物的合適宿主，具體而言，宿主菌株優選地是毀絲霉屬，最優選為嗜熱毀絲霉。該宿主細胞可以是毀絲霉宿主細胞或者經遺傳修飾的宿主細胞。
9、“基因組編輯”，是指對生物的基因組dna進行刪除、插入或者替換，從而達到對目的序列修改的目的。
10、“crispr-cas9編輯技術”，是指cas9蛋白能夠在引導sgrna的指導下在生物基因組中切割特定的dna序列，制造dna雙鏈斷裂，從而引發細胞自身的修復機制，在dsb部位進行非同源末端連接修復(non-homologous?end?joining，nhej)或同源重組(homologousrecombination，hr)修復，從而進行基因敲除、基因滅活、基因敲入和基因替換，實現基因組高效編輯的目的。
11、“靶標位點”或者“protospacer”，是指限定核酸的一部分的核酸序列，是指引導rna(sgrna)5′端的20堿基的序列，這段序列與目的dna序列相同，在存在足以結合的條件下，sgrna需要這段序列與目的dna結合，cas9與sgrna的復合體對目的dna進行剪切。
12、“序列”是指任意合適長度的核苷酸序列，其可以是dna或rna；可以是線狀、環狀或分支狀，而且可以是單鏈或者雙鏈。術語“供體dna序列”是指被插入基因組中的核苷酸序列。供體序列可以為任意長度，例如，優選長度在約500個與3,000個核苷酸之間(或它們之間的任意整數值)。
13、本專利技術獲得下述有益效果：本專利技術通過對固醇調節元件結合蛋白(sterolregulatory?element?binding?protein,srebp)通路的多個基因進行研究，最終發現對毀絲霉細胞進行遺傳操作以缺失或降低mycth_2300902和mycth_2306768基因的活性，其能夠顯著提升纖維素酶和淀粉水解酶的生產水平。在一個具體實驗中，本專利技術利用crispr-cas9編輯技術敲除嗜熱毀絲霉基因mycth_2300902和mycth_2306768，得到基因編輯缺失突變菌株，獲得的突變菌株δm本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種提高絲狀真菌，例如毀絲霉屬（Myceliophthora）胞外蛋白生產水平的方法，其特征在于，是將毀絲霉的基因Mycth_2300902和基因Mycth_2306768中的一種或兩種失活或降低，以提高其分泌蛋白質的能力。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因Mycth_2300902的氨基酸序列如SEQID?NO.1所示，所述基因Mycth_2306768的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因Mycth_2300902的核苷酸序列如SEQID?No.3所示，所述基因Mycth_2306768的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述Mycth_2300902和Mycth_2306768基因失活或降低是通過對其基因表達盒完全或部分缺失、通過插入失活或通過使得基因對于它的預期目的無功能化的手段以阻止所述基因表達功能蛋白，或者降低功能蛋白的表達。
5.如權利要求4所述的方法，其是通過遺傳操作是使毀絲霉細胞中的基因Myc
6.如權利要求1至5任一項所述的方法，其特征在于，所述毀絲霉是嗜熱毀絲霉（Myceliophthora?thermophila）。
7.如權利要求1至5任一項所述的方法，其特征在于，所述提高的分泌蛋白質是指參與木質纖維素降解和淀粉水解的蛋白質。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白質是纖維素酶或糖化酶。
9.通過如權利要求1至8任一項所述的方法得到的重組菌株。
10.利用如權利要求9所述的重組菌株降解木質纖維素材料的方法，其特征在于，在木質纖維素原料或木質纖維素誘導物存在下，培養權利要求9所述的重組菌株，從而降解木質纖維素。
...【技術特征摘要】
1.一種提高絲狀真菌，例如毀絲霉屬（myceliophthora）胞外蛋白生產水平的方法，其特征在于，是將毀絲霉的基因mycth_2300902和基因mycth_2306768中的一種或兩種失活或降低，以提高其分泌蛋白質的能力。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因mycth_2300902的氨基酸序列如seqid?no.1所示，所述基因mycth_2306768的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因mycth_2300902的核苷酸序列如seqid?no.3所示，所述基因mycth_2306768的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述mycth_2300902和mycth_2306768基因失活或降低是通過對其基因表達盒完全或部分缺失、通過插入失活或通過使得基因對于它的預期目的無...
【專利技術屬性】
技術研發人員：田朝光，劉倩，祝志堅，劉丹丹，張曼玉，孫文良，孫濤，
申請(專利權)人：中國科學院天津工業生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
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