【技術實現步驟摘要】
本申請涉及生物，具體涉及一種dnase?i表達純化的方法。
技術介紹
1、dnase?i(脫氧核糖核酸酶i)，即deoxyribo?nuclease?i，是一種可消化單鏈或雙鏈dna的脫氧核糖核酸內切酶，它識別并切割磷酸二酯鍵，產生5'端為磷酸基團、3'端為羥基的單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸。dnase?i的活性依賴于ca2+，并可被二價金屬離子mg2+、mn2+等激活。在mg2+存在的情況下，該酶可隨機識別并切割雙鏈dna任意一條鏈上的任意位點；而在mn2+存在的情況下，可識別并切割dna兩條鏈上幾乎相同的位點，產生平末端或有1-2個核苷酸突出的粘末端dna片段。
2、dnase?i主要適用于rna提取、體外轉錄、rt-pcr實驗中dna的去除，dnase?i印跡，缺口平移(nick?translation)，dna隨機片段文庫構建等分子生物學實驗。目前主流的表達dnase?i的方式主要有兩種，分別是大腸桿菌表達和酵母表達。使用大腸桿菌作為宿主菌表達dnase?i，常常形成包涵體，包涵體本身沒有活性，必須采用變復性工藝后獲得正確折疊的蛋白，但dnase?i包涵體變復性工藝難度較高，只能獲得極少量的有活性的dnase?i，回收率很低，變復性難度較大。使用畢赤酵母作為宿主菌，簡化了技術路線，可以將表達蛋白分泌到細胞外至培養基中，相比與大腸桿菌胞內表達毒性蛋白，更容易獲得較高的蛋白表達量。現有技術中也有成功使用畢赤酵母成功表達dnase?i，但是基本都只是在搖瓶水平進行目的蛋白的表達，對于蛋白的表達量和酶活都沒
3、因此，亟需一種能夠提高dnase?i的表達量且目的蛋白酶活性高的表達純化的方法。
技術實現思路
1、為了提高dnase?i的表達量并保證目的蛋白具有較高的酶活性，本申請提供了一種dnase?i表達純化的方法。
2、本申請的dnase?i表達純化方法采用如下技術方案：
3、一方面，本申請提供了一種dnase?i表達純化的方法，所述方法包括以下步驟，
4、步驟1、按照2％-5％的接種量將含有dnase?i表達菌株的種子液接種至bmgy培養基中，培養14-18h；
5、步驟2、添加50％的甘油至所述發酵液中進行甘油補料，補料完成后繼續發酵2-4h；
6、步驟3、添加甲醇補料液至步驟2獲得的發酵液中進行甲醇補料，所述甲醇補料液為含有8-12g/l酵母提取物，20-25g/l蛋白胨的50％甲醇溶液，所述補料時間為96-120h；
7、步驟4、將步驟3獲得的發酵液進行純化。
8、在一些實施方案中所述甲醇補料液中的酵母提取物含量為9-12g/l、10-12g/l，優選為，9g/l、10g/l、11g/l、12g/l，更優選為10g/l。
9、在一些實施方案中所述甲醇補料液中的蛋白胨的含量為16-24g/l、18-22g/l、20-21g/l，優選為，15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、21g/l、22g/l、23g/l、24g/l、25g/l，更優選為20g/l。
10、采用上述技術方案，通過添加含有8-12g/l酵母提取物，15-25g/l蛋白胨的50％甲醇溶液，能夠在發酵過程中為菌株提供充分的營養條件保證，目的蛋白的降解現象得到明顯抑制，相對于現有技術而言發酵獲得的目的蛋白dnase?i表達量明顯提高；同時，目的蛋白dnase?i單位發酵液的酶活也得到了明顯提高，高達到3×107u/l。
11、進一步地，所述種子液的制備方法為，將構建好的dnase?i表達菌株接種至bmgy培養基中，28-30℃、160-220rpm培養20-26h。
12、進一步地，所述菌株為畢赤酵母或大腸桿菌，優選為，畢赤酵母。
13、采用上述技術方案，使用畢赤酵母分泌表達dnase?i酶相比與使用大腸桿菌表達dnase?i酶，可以獲得更高的比酶活個蛋白表達量。
14、進一步地，發酵溫度28-30℃，ph?5-6，通氣量0.5-2vvm，轉速200-1000rpm。
15、進一步地，所述步驟2中補料具體為以5-10ml/(l·h)的速度補料6-8h。
16、進一步地，所述步驟3中補料具體為以2-4ml/(l·h)的速度補料12-16h，之后將速度提高至4-8ml/(l·h)，保持到補料結束。
17、采用上述技術方案，在目的蛋白表達過程中，畢赤酵母先利用培養基營養成分生長，經培養基中的甘油消耗完后導致培養基中的溶氧值快速上升，進行甘油補料，停止甘油補料后培養基的溶氧值進一步上升，使畢赤酵母處于饑餓狀態。此時，添加含有酵母提取物和蛋白胨的甲醇補料液進行補料，專利技術人發現，補料速度過快會降低dnase?i的比活，補料速度過慢會影響蛋白表達量，優化后補料速度設定為2-4ml/(l·h)，保持12-16h，之后將補料速度提高至4-8ml/(l·h)，保持到發酵結束，可以獲得具有高表達量和酶比活。
18、進一步地，在步驟4之前還包括前處理步驟，所述前處理步驟具體為，在步驟3獲得的發酵液中加入1m氯化鈣溶液，邊加入邊攪拌，并調節ph為7-8，室溫靜置25-35min后，離心取上清。
19、進一步地，所述氯化鈣溶液與所述發酵液的體積比為(0.5-1.5):10。
20、采用上述技術方案，在發酵液中添加氯化鈣可以明顯提高發酵液離心后的澄清度，同時不影響后續過柱層析的富集過程。
21、進一步地，所述純化的步驟為，將發酵液離心去上清后，使用50％ams重懸沉淀，再次離心去上清，使用ni平衡buffer重懸沉淀，過柱層析，收集洗脫樣品。
22、另一方面，本申請還提供了采用上述方法表達純化得到的目的蛋白dnase?i，所述目的蛋白dnase?i的酶比活為3×107u/l。
23、綜上所述，本申請相對于現有技術而言具有以下技術效果：
24、1)本申請提供了一種dnase?i表達純化的方法，該方法采用含有酵母提取物和蛋白胨的甲醇溶液進行補料，并調整補料的速度和方式，可以明顯提高目的蛋白dnase?i的表達量，同時還可以明顯抑制目的蛋白的降解現象。采用本申請的表達純化方法制得的目的蛋白dnase?i單位發酵液酶活約3×107u/l。
25、2)本申請提供的方法在發酵罐中可以高量表達目的蛋白dnase?i酶，生產效率高，操作簡單便捷，能夠很好的滿足市場需求。
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1.一種DNase?I表達純化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟，
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述種子液的制備方法為，將構建好的DNase?I表達菌株接種至BMGY培養基中，28-30℃、160-220?rpm培養20-26h。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌株為畢赤酵母。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，發酵溫度28-30℃，pH?5-6，通氣量0.5-2VVM，轉速200-1000rpm。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中補料具體為以5-10ml/(L?h)的速度補料6-8h。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中補料具體為以2-4?ml/(L?h)的速度補料12-16h，之后將速度提高至4-8?ml/(L?h)，保持到補料結束。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟4之前還包括前處理步驟，所述前處理步驟具體為，在步驟3獲得的發酵液中加入1M氯化鈣溶液，邊加入邊攪拌，并調節pH為7-8，室溫靜置25-35
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述氯化鈣溶液與所述發酵液的體積比為（0.5-1.5）:10。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述純化的步驟為，將發酵液離心去上清后，使用50%AMS重懸沉淀，再次離心去上清，使用Ni平衡buffer重懸沉淀，過柱層析，收集洗脫樣品。
10.采用權利要求1-9任一所述的方法表達純化得到的目的蛋白DNase?I，其特征在于，所述目的蛋白DNase單位發酵液酶活約3×107U/L。
...【技術特征摘要】
1.一種dnase?i表達純化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟，
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述種子液的制備方法為，將構建好的dnase?i表達菌株接種至bmgy培養基中，28-30℃、160-220?rpm培養20-26h。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌株為畢赤酵母。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，發酵溫度28-30℃，ph?5-6，通氣量0.5-2vvm，轉速200-1000rpm。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中補料具體為以5-10ml/(l?h)的速度補料6-8h。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中補料具體為以2-4?ml/(l?h)的速度補料12-16h，之后將速度...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李劼，李超，武瑾賢，趙萍萍，
申請(專利權)人：金宇保靈生物藥品有限公司，
類型：發明
國別省市：
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