【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分泌型靶向cd133的car-t細胞，特別涉及一種分泌ecntfr重組蛋白且靶向cd133的car-t細胞，以及該car-t細胞的制備方法與用途。
技術(shù)介紹
1、原發(fā)性肝癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療仍難有效治療腫瘤，迫切需要開發(fā)新的治療手段，免疫治療已成為當前腫瘤治療研究和臨床應(yīng)用的熱點。其中，通過基因工程手段在體外修飾t細胞后再回輸至患者體內(nèi)的car-t細胞療法，在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤中已取得令人鼓舞的療效，但其在惡性實體瘤中的治療效果不佳，因此有必要研究如何改進car-t細胞的功能，使之能在惡性實體瘤中取得更好的療效。
2、cd133是一種跨膜糖蛋白，有研究報道，cd133在中晚期肝癌中高表達，除此之外，cd133還是腫瘤干細胞和內(nèi)皮祖細胞的標志，常常與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，因此，靶向cd133的car-t細胞在治療原發(fā)性肝癌中對抑制肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移會有較好的作用。然而在臨床試驗研究中，靶向cd133的car-t細胞對原發(fā)性肝癌患者的緩解率比較低，究其原因，發(fā)現(xiàn)：在肝癌微環(huán)境中，與肝癌細胞接觸的基質(zhì)細胞分泌生長因子和細胞因子，其可通過向肝癌細胞發(fā)信號直接起作用或通過募集其他基質(zhì)成分間接起作用，抵制t細胞的腫瘤殺傷功能，該過程的一個重要方面是腫瘤相關(guān)成纖維細胞(caf)的擴增。caf是多種基質(zhì)細胞，在不同的腫瘤和組織中具有不同的特征，caf通過分泌刺激腫瘤細胞生長的可溶性因子來支持體內(nèi)癌細胞的生長。心肌營養(yǎng)素樣細胞因子1(clcf1)是caf分泌的
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的第一個目的是提供一種分泌型靶向cd133的car-t細胞。該car-t細胞能表達cd133-car靶向cd133的同時分泌ecntfr重組蛋白，可作用于腫瘤抑制性免疫微環(huán)境中的免疫細胞，提高其免疫細胞的活性，有效克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，進而增強car-t細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。
2、本專利技術(shù)所述的分泌型靶向cd133的car-t細胞，表達cd133-car的同時分泌可溶性重組蛋白ecntfr，所述cd133-car包括用于識別cd133抗原的scfv區(qū)域。
3、本專利技術(shù)的第二個目的是提供所述分泌型靶向cd133的car-t細胞的制備方法，該方法制備出的car-t細胞既有針對cd133表達高的腫瘤細胞的特異性抗腫瘤作用，又能高水平表達可溶性重組蛋白ecntfr，阻礙腫瘤抑制性免疫微環(huán)境的形成。
4、本專利技術(shù)所述的分泌型靶向cd133的car-t細胞的制備方法，包括如下步驟：
5、a.構(gòu)建攜帶cd133-car及可溶性重組蛋白ecntfr基因的慢病毒質(zhì)粒骨架，得到重組慢病毒質(zhì)粒；
6、b.將所述重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞，制備可感染t細胞的重組慢病毒載體；
7、c.將所述重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入活化的t細胞，得到car-t細胞；
8、d.將所述car-t細胞進行體外培養(yǎng)，擴增，收集，得到所述的分泌型靶向cd133的car-t細胞。
9、根據(jù)本專利技術(shù)所述的制備方法的進一步特征，所述步驟a中，所述的重組慢病毒質(zhì)粒是第三代的慢病毒轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，是重組后的復(fù)制缺陷型慢病毒質(zhì)粒，能將外源片段整合入宿主基因，一次性使用，無法復(fù)制和增殖，安全可靠。
10、根據(jù)本專利技術(shù)所述的制備方法的進一步特征，所述步驟a中，所述重組慢病毒質(zhì)粒依次包含ef1啟動子序列、cd133單鏈抗體(scfv)、c-myc、cd8嵌合受體跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)、p2a、可溶性重組蛋白ecntfr序列。
11、所述cd133-car的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)包含編碼共刺激因子區(qū)域，該共刺激因子區(qū)域選自4-1bb、cd28、cd27、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、light、b7-h3、特異性結(jié)合cd83的配體、icam-1、hvem(lightr)、cd160、淋巴細胞功能相關(guān)的抗原-1(lfa-1)、il2rα、cd103、cd11b、cd11c、trance/rankl、slamf4(cd244,2b4)、cd69、slam(slamf1、cd150、ipo-3)中的一種或多種的任意組合。
12、作為本專利技術(shù)優(yōu)選的技術(shù)方案，所述共刺激因子區(qū)域為cd28；所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)為cd28-cd3ζ。
13、根據(jù)本專利技術(shù)所述的制備方法的進一步特征，所述步驟b中，所述宿主細胞為293t細胞。
14、根據(jù)本專利技術(shù)所述的制備方法的進一步特征，所述步驟b中，還包括兩個輔助質(zhì)粒pspax和pmd2g。
15、本專利技術(shù)的第三個目的是提供該所述的分泌型靶向cd133的car-t細胞的用途，具體是用于制備治療癌癥的藥物的用途。
16、優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的分泌型靶向cd133的car-t細胞可用于制備治療肝癌的藥物。
17、優(yōu)選地，所述藥物是靶向cd133陽性的腫瘤干細胞的藥物。
18、本專利技術(shù)所述的分泌型靶向cd133的car-t細胞是雙靶點car-t細胞，在靶向cd133的同時可分泌可溶性重組蛋白ecntfr。ecntfr可改善肝癌抑制性免疫微環(huán)境，有利于增強cd133的car-t細胞的抗腫瘤能力。cd133-car的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)包含編碼共刺激因子區(qū)域，一種或多種共刺激因子組合可使cd133的car-t細胞持續(xù)活化增殖，可溶性重組蛋白持續(xù)分泌，改善肝癌組織微環(huán)境，增強cd133的car-t細胞殺傷腫瘤細胞作用及免疫細胞的記憶。
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1.一種分泌型靶向CD133的CAR-T細胞，其特征在于：所述CAR-T細胞表達CD133-CAR的同時分泌可溶性重組蛋白eCNTFR，所述CD133-CAR包括用于識別CD133抗原的scFv區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的分泌型靶向CD133的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟A中，所述的重組慢病毒質(zhì)粒是第三代的慢病毒轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟A中，所述重組慢病毒質(zhì)粒依次包含EF1啟動子序列、CD133單鏈抗體(scFv)、c-myc、CD8嵌合受體跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)、P2A、可溶性重組蛋白eCNTFR序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)為CD28-CD3ζ。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟B中，所述宿主細胞為293T細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟B中，還包括兩個輔助質(zhì)粒PspAX和PMD2G。p>
8.如權(quán)利要求1所述的分泌型靶向CD133的CAR-T細胞用于制備治療癌癥的藥物的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于：所述癌癥是肝癌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于：所述藥物是靶向CD133陽性的腫瘤干細胞的藥物。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種分泌型靶向cd133的car-t細胞，其特征在于：所述car-t細胞表達cd133-car的同時分泌可溶性重組蛋白ecntfr，所述cd133-car包括用于識別cd133抗原的scfv區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的分泌型靶向cd133的car-t細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟a中，所述的重組慢病毒質(zhì)粒是第三代的慢病毒轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟a中，所述重組慢病毒質(zhì)粒依次包含ef1啟動子序列、cd133單鏈抗體(scfv)、c-myc、cd8嵌合受體跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)、p2...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：夏建川，潘求忠，向橦，張昊，
申請(專利權(quán))人：中山大學(xué)腫瘤防治中心中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，中山大學(xué)腫瘤研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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