【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于食品檢測，具體涉及一種金黃色葡萄球菌適配體及其用于檢測探針的制備方法。
技術介紹
1、近年來，食源性致病微生物污染對食品安全的影響日益突出，給人們的健康帶來極大威脅。金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aure，s.aure)是一種重要的食源性致病微生物和人獸共患病原菌，葡萄球菌性食物中毒是攝入了受腸毒素污染的乳制品、肉類、蛋類制品引起的。s.aure廣泛存在于自然界中，大約20％～30％的普通人群是金黃色葡萄球菌攜帶者，具有兼性厭氧、耐高溫、高鹽的特性，易存活，并隨著人類和動物的活動進行傳播，威脅人類和動物的生命安全。據世界衛生組織估計，全球每年約6億人因食用受污染的食物而患病，約42萬人死亡。在我國，約有10％～25％的食物中毒事件由金黃色葡萄球菌引起，嚴重威脅食品安全和國民健康?？股氐牟缓侠硎褂?、甚至濫用的情況尤為突出，導致菌株耐藥性不斷增強。據報道，以耐甲氧西林金葡菌感染已經和乙型肝炎病毒、獲得性免疫缺陷綜合征感染并列為世界范圍內3大難解決感染性疾病，所以對食品中金黃色葡萄球菌及其生物標志物的快速檢測是保障食品安全的重要措施。
2、目前，金黃色葡萄球菌傳統的檢測手段主要是細菌增菌培養、形態學鑒定、生化鑒定等，整個鑒定過程耗時3～5d，且操作復雜；熒光聚合酶鏈反應檢測方法的檢測時間通常在1h以上，且設備昂貴，檢測成本較高。
3、相比于傳統的檢測方法，通過核酸適配體結合金納米粒子建立的檢測傳感體系不僅操作簡單且具有較好的靈敏度，有望成為快速檢測領域的新趨勢。核酸適配體是指一種
技術實現思路
1、針對傳統金黃色葡萄球菌檢測方法耗時長、操作復雜、設備昂貴、檢測成本較高等問題，本專利技術提供一種基于熒光猝滅原理的快速檢測方法；針對雙適配體夾心的方式失敗率較高，需要使用新的核酸適配體來組合使用，很容易出現菌體表面全被其中一種熒光探針占滿，致使另一熒光探針無法使用的問題，本專利技術基于蟻群算法及分子對接等技術篩選了靶向金黃色葡萄球菌的膜蛋白fnbpa蛋白的核酸適配體即第一適配體，其靶標與第二適配體的靶標不一致，基于適配體及其熒光淬滅檢測方法。
2、一種金黃色葡萄球菌適配體的dna序列如seq?id?no:1所示。
3、篩選操作步驟如下：
4、(1)構建金黃色葡萄球菌的膜蛋白的結構
5、獲取金黃色葡萄球菌的膜蛋白fnbpa蛋白的氨基酸序列及其結構信息；
6、(2)將步驟(1)獲取的金黃色葡萄球菌的膜蛋白進行分子對接測試
7、隨機設計容量為1014的短鏈寡dna片段文庫，其中短鏈寡dna片段的長度范圍為30bp-80bp；將步驟(1)中金黃色葡萄球菌的膜蛋白fnbpa蛋白的結構信息導入autodock分子模擬軟件，接著進行短鏈寡dna片段文庫與膜蛋白fnbpa蛋白的表面結構域進行分子對接，得到每一個短鏈寡dna片段與膜蛋白fnbpa蛋白之間結合的自由能；
8、(3)將步驟(2)獲取的分子對接的結果進行蟻群算法模型的優化
9、結合改進的蟻群算法模型對上述結合的自由能進行優化處理，其中模型的算法公式如下：
10、
11、τ(i,j)＝(1-ρ)·τ(i,j)+ρ·δτ(i,j)k(ii)，
12、式中，pij(t)表示螞蟻k從節點i到節點j的轉移概率值，τij(t)表示t時刻節點i到節點j的信息素濃度，ηij(t)表示t時刻節點i到節點j的常量啟發函數，α表示信息素增強系數，β表示啟發式信息系數，l表示短鏈寡dna片段的結合自由能的指定位置，τil(t)表示t時刻節點i到節點l的信息素濃度，ηil(t)表示t時刻節點i到節點l的常量啟發函數，allowedi表示i節點下一步允許選擇的節點集，τ(i,j)表示螞蟻k經節點i到節點j釋放的信息素之和，ρ表示信息素揮發系數(0<ρ<1)，δτ(i,j)k表示螞蟻k經節點i到節點j釋放的信息素增加量；
13、根據優化處理的結果，統計pij(t)對應的短鏈寡dna片段，得到匹配的金黃色葡萄球菌的核酸適配體。
14、基于所述的金黃色葡萄球菌適配體用于檢測探針的制備方法，其特征在于，操作步驟如下：
15、1)制備第一活化混合液
16、按體積比1:1，將濃度10mm的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和濃度5mm的n-羥基琥珀酰亞胺混合，得到第一活化混合液；
17、(2)制備第二活化混合液
18、在3-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽中加入純水，得到終濃度2.867g/l的3-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽溶液，即第二活化混合液；
19、(3)制備熒光探針
20、在1ml?n-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷中加入6ml去離子水；再加入8.0mg阿米酚，連續攪拌30min；在200℃下加熱6h，冷卻至室溫；加入純水稀釋20倍，得到反應液；將500ul反應液和200ul第一活化混合液渦旋混合，以180rpm、室溫條件下搖床孵育30min；再加入180ul體積濃度10umol/l的第一適配體溶液渦旋混合，以180rpm、室溫條件下搖床孵育2.5h，制得熒光探針，4℃包裹錫紙避光保存；
21、所述第一適配體溶液中的第一適配體的dna序列如seq?id?no:1所示，所述第一適配體的5’端用羧基進行修飾；
22、(4)制備淬滅探針
23、(4.1)將1ml質量濃度1％的四氯金酸溶液加入到100ml蒸餾水中，煮沸；快速加入3ml質量濃度1％的檸檬酸三鈉溶液，繼續煮沸15min，自然冷卻至室溫，得到金納米粒子溶液；
24、(4.2)將80μl體積濃度10μm的第二適配體溶液，在95℃條件下水浴5min，在4℃條件下冷卻5min，得到退火溶液本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種金黃色葡萄球菌適配體，其特征在于：所述金黃色葡萄球菌適配體的DNA序列如SEQ?ID?No:1所示；
2.將權利要求1所述的金黃色葡萄球菌適配體用于檢測探針的制備方法，其特征在于，操作步驟如下：
【技術特征摘要】
1.一種金黃色葡萄球菌適配體，其特征在于：所述金黃色葡萄球菌適配體的dna序列如seq?id?no:1所示；...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙文華，葉應旺，陳韓芳，占英，李輝，任玉偉，章欣，余小雨，吳偉超，李夢宇，
申請(專利權)人：合肥工業大學，
類型：發明
國別省市：
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