【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體地說，涉及紅緣擬層孔菌實時熒光raa檢測引物和探針及檢測方法。
技術介紹
1、冷杉作為西藏林芝地區重要的林木資源，對維護生態平衡和當地經濟發展具有重要意義。然而，近年來在林芝地區發現冷杉心腐病大量發生，導致大量冷杉死亡，嚴重破壞了當地的森林資源。在對冷杉倒腐木的深入研究中，發現在冷杉心腐病發生樹木及其周圍區域頻繁出現紅緣擬層孔菌（ fomitopsis?pinicola），這一現象引起研究人員的高度關注。
2、紅緣擬層孔菌是一種廣泛分布于各種林木中的真菌，具有較強的木質素分解能力。該菌能夠侵入樹木體內，通過分泌酶類降解木質部組織，導致樹木心材腐朽，最終引發樹木死亡。結合冷杉心腐病的癥狀表現和擬層孔菌的生物學特性，有理由推斷紅緣擬層孔菌是冷杉心腐病的病原菌。
3、盡管初步推斷紅緣擬層孔菌是冷杉心腐病的病原菌，但當前針對該病害的檢測手段仍存在諸多不足。傳統的檢測方法如形態學鑒定和分子生物學鑒定，雖然準確性較高，但操作復雜、耗時長，且需要專業的實驗設備和人員，難以滿足現場快速檢測的需求。特別是在西藏林芝這樣的偏遠地區，缺乏先進的實驗條件和專業技術人員，導致病害監測和防控工作滯后。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供紅緣擬層孔菌實時熒光raa檢測引物和探針及檢測方法。
2、本專利技術根據紅緣擬層孔菌的tef基因（ncbi編號：mk236361.1）設計raa檢測引物，引物設計
3、為了實現本專利技術目的，第一方面，本專利技術提供一種紅緣擬層孔菌（ fomitopsis? pinicola）實時熒光raa檢測引物和探針，實時熒光raa檢測引物fpkf3和fpkr2的序列如seqid?no:1-2所示，探針的序列如seq?id?no:3所示。
4、上游引物fpkf3:?5’-ccatcaattttcatgttgctgatgcgctttgc-3’（seq?id?no:1）
5、下游引物fpkr2:?5’-tgccgctgaccatctgcaacacttacttgaca-3’（seq?id?no:2）
6、探針:?5’-tcaagaaggtcggatacaacccgaaggctgtctccttcgtccccatct-3’（seq?idno:3）
7、第二方面，本專利技術提供紅緣擬層孔菌實時熒光raa檢測試劑盒，包括如seq?id?no:1-2所示的實時熒光raa檢測引物fpkf3和fpkr2以及探針raa-kp；
8、探針raa-kp為：
9、5’-tcaagaaggtcggatacaacccgaaggctg/i6famdt//idsp//ibhq1?dt/ccttcgtccccatct-spc3-3’；
10、其中，i6fam?dt為熒光基團標記的堿基t，ibhq1?dt為淬滅基團標記的堿基t，spc3為阻斷基團c3-spacer。idsp為internal?d-spacer，又稱/thf/或abasic，其作為一種堿基修飾，代表在寡核苷酸內部添加一個四氫呋喃(thf)間隔基。
11、進一步地，所述實時熒光raa檢測試劑盒還包括raa反應緩沖液、純化水（去核酸酶水）、凍干粉、乙酸鎂等。
12、第三方面，本專利技術提供紅緣擬層孔菌的實時熒光raa檢測方法，包括以下步驟：
13、（1）提取待測樣品的基因組dna作為模板；
14、（2）利用所述實時熒光raa檢測試劑盒進行實時熒光raa檢測：將12.5μl?raa反應緩沖液、10μm?fpkf3和10μm?fpkr2各1.05μl、10μm?raa-kp?0.3?μl、6.6μl?純化水，1μl?dna模板，加至含有凍干粉的pcr管（一管是兩份的量）中，最后加入2.5μl乙酸鎂，在39℃條件下靜置4min后取出，用手彈pcr管，將體系充分混勻后置于離心機短暫離心；
15、（3）離心后將pcr管放置于熒光檢測儀中，程序設置為恒溫39℃，每30s采集一次熒光信號，循環50次，反應時間為25min；反應結束后，分析實時熒光raa檢測結果。
16、借由上述技術方案，本專利技術至少具有下列優點及有益效果：
17、（一）本專利技術提供一種紅緣擬層孔菌的raa（重組酶輔助擴增）熒光檢測法，該方法具有操作簡便、快速高效、靈敏度高的特點，能夠在現場條件下實現對冷杉心腐病的快速準確診斷，為病害的及時防控提供技術支持。
18、（二）本專利技術提供的基于實時熒光raa檢測紅緣擬層孔菌的引物組無假陽性，擴增效果好且具有高度特異性。檢測靈敏度為普通pcr法的十倍。
19、（三）采用基于本專利技術引物組的實時熒光raa可以對紅緣擬層孔菌進行現場快速實時檢測，操作簡單，不需要復雜的溫控設備，克服了對實驗室設備的依賴性，可以在設備條件不充足的現場地區進行現場檢測，省去了樣品運輸的時間，同時避免了運輸對檢測結果的影響。
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1.紅緣擬層孔菌（Fomitopsis?pinicola）實時熒光RAA檢測引物和探針，其特征在于，實時熒光RAA檢測引物FPKF3和FPKR2的序列如SEQ?ID?NO:1-2所示，探針的序列如SEQ?IDNO:3所示。
2.紅緣擬層孔菌實時熒光RAA檢測試劑盒，其特征在于，包括如SEQ?ID?NO:1-2所示的實時熒光RAA檢測引物FPKF3和FPKR2以及探針RAA-KP；
3.根據權利要求2所述的實時熒光RAA檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括RAA反應緩沖液、純化水、凍干粉、乙酸鎂。
4.紅緣擬層孔菌的實時熒光RAA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
【技術特征摘要】
1.紅緣擬層孔菌（fomitopsis?pinicola）實時熒光raa檢測引物和探針，其特征在于，實時熒光raa檢測引物fpkf3和fpkr2的序列如seq?id?no:1-2所示，探針的序列如seq?idno:3所示。
2.紅緣擬層孔菌實時熒光raa檢測試劑盒，其特征在于，包括如seq?i...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王永林，孔亞馨，李江榮，武瑾，唐晨，張更新，羅大慶，姜寧，唐曉琴，王超，李杰婷，李祎，
申請(專利權)人：北京林業大學，
類型：發明
國別省市：
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