【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，具體涉及一種單鏈結(jié)合蛋白的制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、單鏈結(jié)合蛋白(ssb,single?strand?dna-binding?protein)，又稱dna結(jié)合蛋白,是dna復(fù)制所必須的，單鏈結(jié)合蛋白在dna復(fù)制中具有多種功能,包括通過(guò)與dna解旋酶作用來(lái)增強(qiáng)螺旋不穩(wěn)定性、防止單鏈重新退火和防止核酸酶消化；復(fù)制起點(diǎn)的組織和穩(wěn)定；初級(jí)體組裝；引發(fā)特異性；復(fù)制保真度的增強(qiáng)；增強(qiáng)聚合酶的持續(xù)合成能力；促進(jìn)聚合酶與模板的結(jié)合等功能，因此被廣泛用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。
2、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技術(shù)使不借助精密溫度循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增逐漸成為可能。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)通過(guò)模擬dna體內(nèi)擴(kuò)增，在等溫條件下產(chǎn)生目的片段，該技術(shù)主要依賴重組酶uvsx、單鏈結(jié)合蛋白gp32和鏈置換dna聚合酶bsu。重組酶uvsx能夠不通過(guò)加熱就解開(kāi)雙鏈dna。重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，重組酶uvsx在atp的參與下結(jié)合引物，形成核酸蛋白復(fù)合體，這些復(fù)合體能夠掃描與引物序列互補(bǔ)的目標(biāo)雙鏈dna。接著，核酸蛋白復(fù)合體侵入5'端位點(diǎn)形成d狀環(huán)。單鏈結(jié)合蛋白gp32與被置換單鏈結(jié)合使其穩(wěn)定。同時(shí)，重組酶uvsx離開(kāi)寡核苷酸的3’端，降解后被dna聚合酶利用。之后，鏈置換dna聚合酶bsu結(jié)合在核酸蛋白復(fù)合體的游離3'端，進(jìn)行鏈延伸，形成新的互補(bǔ)鏈。在鏈延伸的過(guò)程中，新合成的單鏈與原始互補(bǔ)鏈配對(duì)。以上步驟循環(huán)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)dna的指數(shù)
3、但是單鏈結(jié)合蛋白中的核酸殘留，尤其是宿主dna殘留，會(huì)干擾單鏈結(jié)合蛋白的功能，因?yàn)樗鼤?huì)影響單鏈結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性和標(biāo)記單鏈dna的能力，因此宿主dna殘留水平需要極低；核酸酶殘留，可能會(huì)降解單鏈結(jié)合蛋白所結(jié)合的單鏈dna，例如在依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（nucleic?acid?sequence-based?amplification,nasba）中，單鏈結(jié)合蛋白的一個(gè)重要應(yīng)用是穩(wěn)定單鏈dna，減少nasba中對(duì)熱退火步驟的依賴，如果存在核酸酶殘留，它們可能會(huì)降解單鏈dna，影響gp32的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響nasba或其他依賴于單鏈dna穩(wěn)定性的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的效果。
4、而現(xiàn)有技術(shù)主要致力于提高單鏈結(jié)合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量，以及提高其純度，以便于更廣泛的應(yīng)用。例如，中國(guó)專利cn108913700a通過(guò)根據(jù)密碼子偏好性優(yōu)化了gp32的編碼基因，使得gp32蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)，且表達(dá)的gp32蛋白的純度大于95%；中國(guó)專利cn108559756a則是提供了一種重組酶uvsx的制備方法、表達(dá)基因及重組表達(dá)載體，達(dá)到了重組酶uvsx基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)大量可溶性表達(dá)，且表達(dá)的重組酶uvsx的純度大于95％的技術(shù)效果。
5、但現(xiàn)有技術(shù)中均未提供核酸、核酸酶殘留相關(guān)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)。因此目前亟須開(kāi)發(fā)一種無(wú)核酸和/或核酸酶殘留的單鏈結(jié)合蛋白的制備方法及相應(yīng)的核酸和/或核酸酶殘留的檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述問(wèn)題，本專利技術(shù)提供了一種高效去除宿主細(xì)胞殘留基因組的單鏈結(jié)合蛋白的制備方法及應(yīng)用。
2、一方面，本專利技術(shù)提供了一種單鏈結(jié)合蛋白的制備方法。
3、具體地，所述單鏈結(jié)合蛋白的純化包括以下步驟：
4、（1）親和層析：使用ni-ff作為層析柱的填料；
5、（2）離子交換層析：使用deae?sepharose?ff作為層析柱的填料；
6、（3）疏水層析：使用phenyl-ff作為層析柱的填料；
7、（4）親和層析：使用ni-ff作為層析柱的填料；
8、（5）離子交換層析：使用qhp作為層析柱的填料；
9、（6）分子篩層析：使用sephadex?g-25作為層析柱的填料。
10、進(jìn)一步具體地，所述親和層析使用的緩沖液包括：
11、ni-結(jié)合緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷、0.1-0.5m?氯化鈉、5-15mm咪唑和3%-8%甘油，ph?7.8-8.2；
12、ni-洗滌緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷、0.1-0.5m?氯化鈉、5-15mm咪唑、0.5%-1.5%triton-x100和3%-8%甘油，ph?7.8-8.2；
13、ni-洗脫緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷、0.1-0.5m?氯化鈉、400-600mm咪唑和3%-8%甘油，ph?7.8-8.2。
14、進(jìn)一步具體地，步驟（2）和步驟（5）中，所述離子交換層析使用的緩沖液包括：
15、iex-結(jié)合緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷、25-75mm?氯化鈉、5-15mm?二硫蘇糖醇和3%-8%甘油，ph?6.8-7.2；
16、iex-洗脫緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷、400-600mm?氯化鈉、5-15mm?二硫蘇糖醇和3%-8%甘油，ph?6.8-7.2。
17、進(jìn)一步具體地，步驟（2）中所述的離子交換層析使用的填料deae?sepharose?ff的體積為：100-120ml。
18、進(jìn)一步具體地，步驟（5）中所述的離子交換層析使用的填料qhp的體積為：40-60ml。
19、進(jìn)一步具體地，步驟（3）中所述的疏水層析使用的緩沖液包括：
20、hic結(jié)合緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷和1.0-1.5mm硫酸銨，ph?7.3-7.7；
21、hic洗脫緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷，ph?7.3-7.7；
22、hic洗滌緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷和40%-60%乙二醇，ph?7.3-7.7。
23、進(jìn)一步具體地，步驟（6）中所述的分子層析使用的填料sephadex?g-25的體積為300-350ml。
24、進(jìn)一步具體地，步驟（6）中所述的分子層析使用的緩沖液包括：
25、1×儲(chǔ)存緩沖液：25-75mm?三羥甲基氨基甲烷、400-600mm?氯化鈉、5-15mm?二硫蘇糖醇和3%-8%甘油，ph?6.8-7.2。
26、具體地，所述的單鏈結(jié)合蛋白由由宿主細(xì)胞表達(dá)。
27、進(jìn)一步具體地，所述宿主細(xì)胞包括：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、植物乳桿菌、釀酒酵母或馬克斯克魯維酵母。
28、進(jìn)一步具體地，用于表達(dá)gp32的載體包括但不限于：pgex、pmal、ptrchis、pbad或pqe。
29、進(jìn)一步具體地，所述單鏈結(jié)合蛋白包括：gp32、uvsx、uvsy、ecssb或重組酶聚合酶擴(kuò)增。
30、在本專利技術(shù)的某些具體實(shí)施例中，所述gp32的氨基酸序列在本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種單鏈結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于，所述單鏈結(jié)合蛋白的純化包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）和步驟（4）中，所述親和層析使用的緩沖液包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）和步驟（5）中，所述離子交換層析使用的緩沖液包括：
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中所述填料DEAESepharose?FF的體積為：100-120mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟（5）中所述的填料QHP的體積為：40-60mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中所述的疏水層析使用的緩沖液包括：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（6）中所述的Sephadex?G-25填料的體積為：300-350mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（6）中所述的分子層析使用的緩沖液包括：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包括：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、植物乳桿菌、釀酒酵母或馬克斯克魯維酵母。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟：
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述單鏈結(jié)合蛋白包括：GP32、UvsX、Uvs?Y、ecSSB或RPA。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的制備方法在制備無(wú)核酸酶殘留和/或無(wú)核酸殘留的單鏈結(jié)合蛋白中的應(yīng)用。
14.一種權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述制備方法制備的單鏈結(jié)合蛋白中核酸酶殘留的檢測(cè)方法。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述核酸酶為脫氧核糖核酸酶時(shí)，探針FAM-GACCTGCTCAGTACGAGAGGACCGCAGGTC-BHQ1的降解量≤1pmol則為無(wú)脫氧核糖核酸酶殘留。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述核酸酶為核糖核酸酶時(shí)，探針FAM-CGUACCUCAUAGUACG-BHQ1的降解量≤1pmol則為無(wú)核糖核酸酶殘留。
17.一種單鏈結(jié)合蛋白中宿主細(xì)胞核酸殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，使用引物SEQ?IDNO.1-2進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，Ct值＞35cycle則無(wú)宿主細(xì)胞核酸殘留。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種單鏈結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于，所述單鏈結(jié)合蛋白的純化包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）和步驟（4）中，所述親和層析使用的緩沖液包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）和步驟（5）中，所述離子交換層析使用的緩沖液包括：
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中所述填料deaesepharose?ff的體積為：100-120ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟（5）中所述的填料qhp的體積為：40-60ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中所述的疏水層析使用的緩沖液包括：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（6）中所述的sephadex?g-25填料的體積為：300-350ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（6）中所述的分子層析使用的緩沖液包括：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述單鏈結(jié)合蛋白由宿主細(xì)胞表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述宿主...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳寧，任黎明，許露露，孫振豐，劉颯颯，張惠丹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：蘇州繪真醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。