【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種雙靶向rna分子的制備方法及應用，更具體一點說，涉及一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法及表達、驗證毒性方法和應用，屬于生物醫藥領域。
技術介紹
1、肝癌是肝臟的惡性腫瘤，在臨床上可分為兩種類型：原發性肝癌和繼發性肝癌。原發性肝癌起源于肝臟，稱為肝細胞癌(hcc)。肝細胞癌被認為是成人中最常見的原發性肝癌，約占原發性肝癌的90％。肝細胞癌為全球第五大常見癌癥，是僅次于胰腺癌的惡性腫瘤，5年生存率僅為18％。在我國每年有11萬患者死于肝癌，肝癌的死亡率僅次于胃癌、食道癌，是第三大常見惡性腫瘤。大多數人的肝癌一旦發現已是中晚期，因此常規的手術治療和化療并不能達成很好的治療效果。近10年用于晚期肝癌患者的治療藥物是索拉菲尼。在2018年，fda新批準樂伐替尼第作為一線hcc治療藥物。二線治療藥物為瑞戈菲尼，這是一種口服多激酶抑制劑，能夠阻斷促進細胞增殖、轉移、血管生成和腫瘤免疫的激酶活性。此外，另一些藥物也作為二線用藥，例如：派姆單抗、納武單抗等。
2、目前，rnai療法被認為是一個有前途的治療平臺，sirna能夠以序列特異性方式敲低靶基因的表達，能夠對各種疾病進行更精確和個性化的治療。但裸sirna不論是在體內還是體外都非常容易降解，因此需要利用納米載體保護sirna以提升其穩定性，同時提高sirna的細胞吸收效率。雖然近幾年間，針對sirna納米載體展開了大量的研究，但廣泛存在存在遞送效率不高，載體自身毒性等問題。
3、高爾基體蛋白-73(gp73)，也被稱為golm
4、端粒是一種特殊的核蛋白，位于線性染色體的末端，作用是保護線性染色體的自然末端，防止dna的斷裂或一些不必要的損傷。細胞每分裂一次，端粒跟著縮短，達到50周期后，端粒長度變得非常短，最短的端粒激活dna損傷信號，通過誘導非同源dna末端鏈接，使細胞衰老逐漸走向凋亡，但癌細胞能夠通過激活端粒酶或端粒替代延長系統修復端粒。在人類中，端粒酶表達僅于干細胞或種系細胞中表達，在正常成人組織中幾乎不表達。但在85-90％的人類癌癥中，從癌癥干細胞到轉移性癌細胞，在腫瘤每個發展階段都可以檢測到端粒酶活性，端粒酶在癌細胞的復制和永生中起到核心作用。在2009年的一份研究中，dong等人設計了靶向htert的sirna，結果顯示htert?sirna在體內和體外都表現出乳腺癌細胞端粒酶活性下調、抑制體內外乳腺癌細胞活力、致使乳腺癌細胞凋亡的作用。因此，端粒酶也是個癌癥治療靶點。
5、目前，研究中沒有用于治療肝癌的沉默htert位點的sirna，市面現存的sirna藥物都依賴于遞送載體，但由于sirna不穩定，在體外或進入體內都極易降解，因此通常需要利用納米載體以提升sirna的穩定性和細胞吸收效率，提高sirna的療效，然而遞送載體不僅會加重腎臟的負擔，也易引發機體的免疫。因此，設計一種能夠同時靶向gp73和htert兩個基因、且結構穩定、rnai效率高的rnai藥物，無需額外的遞送載體，也能對肝癌具有顯著的治療效果。
技術實現思路
1、為了解決上述現有技術問題，本專利技術提供具有既能提升rna的穩定性，避免遞送載體的應用，也能提高對靶基因的沉默效果，以及提升rnai療法的效率等技術特點的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法。
2、本專利技術還提供了雙靶向rna分子在細胞中的毒性驗證方法、雙靶向rna分子沉默肝癌細胞中靶基因的表達以及雙靶向rna分子的應用。
3、為了實現上述目的，本專利技術是通過以下技術方案實現的：
4、一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
5、步驟1)：利用design?of?sirna(dsir)在線sirna設計程序,針對兩個靶基因htert和gp73設計sirna，從中篩選出設計的得分>90和連續相同核苷酸<4的sirna，得到6個sirna，分別為sir1、sir2、sir3、sir4、sir5、sir6；其中，sir1-sir5靶向htert,sir6靶向gp73；
6、步驟2)：將這6個sirna分別利用發夾環序列形成shrna，最后利用tetra-u將shrna串聯，形成一條具有多個發夾結構的長鏈序列，命名為multi-sirna。
7、優選的，sir1序列:uugcuccagacacucuuccgg；
8、sir2序列:uuggucucggcguacaccggg；
9、sir3序列:auagcuggaguagucgcucug；
10、sir4序列:uagauguuggugcacaccguc；
11、sir5序列:uaguugagcacgcugaacagu；
12、sir6序列:uucuauucgcuccucacacug。
13、優選的，所述multi-sirna序列如下：
14、gggcagaguggaccaucauuccuuuugccauagcuggaguagucgcuc
15、ugcaccgcaaggugcagagcgacuacuccagcuauggcuuuugcuacc
16、ggaagagugucuggagcaagaguggaccaucauuccuuuugccuagau
17、guuggugcacaccgucuggcuccggccagacggugugcaccaacaucu
18、aggcuuuugucccccgguguacgccgagaccaagaguggaccaucauu
19、ccuuuugccuaguugagcacgcugaacagugcccgcaagggcacuguu
20、cagcgugcucaacuaggcuuuugccucaggaacaccaagaaguucaaa
21、ggaggcaugaacuucuugguguuccugaggcuuuuggaaugauggucc
22、acucuuggucucggcguacaccgggggacuuuuggaaugaugguccac
23、ucuugcuccagacacucuuccgguagcuuuuggaaugaugguccacuc
24、ugcccggaugguccacuccuuacacuuuu本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向RNA分子的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向RNA分子的制備方法，其特征在于：
3.根據權利要求1或2所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向RNA分子的制備方法，其特征在于：所述multi-siRNA序列如下：
4.根據權利要求3所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向RNA分子的制備方法，其特征在于：multi-siRNA能夠插入特定的表達載體中使其在原核生物中表達。
5.根據權利要求4所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向RNA分子的制備方法，其特征在于：在multi-siRNA的編碼DNA序列的上游增加T7啟動子序列，并在序列兩端分別加上內切酶Bgl?II和Bpu1102?I的酶切位點，通過化學合成得到相應的DNA序列，然后將其插入至原核表達載體pET-28a的Bgl?II和Bpu1102?I的位點之間，將其轉化大腸桿菌HT115(DE3)，經IPTG誘導，可大量合成并在大腸桿菌中積累，能夠大量
6.根據權利要求5所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向RNA分子的制備方法，其特征在于：通過誘導轉化帶有multi-siRNA質粒的大腸桿菌工程菌，提取大腸桿菌總RNA，能夠得到不同于原核生物總RNA的特異條帶以實現探究原核表達的可行性。
7.如權利要求1-6任一項所述的雙靶向RNA分子在細胞中的毒性驗證方法，其特征在于：將vero細胞按5×103cells/well鋪于96孔細胞培養板中，貼壁后分別按照100ng/μL、200ng/μL、500ng/μL、1000ng/μL的濃度將multi-siRNA加入到細胞培養基中，每個濃度設置6個復孔，并且分別于24h、48h、72h時間點加入MTT。
8.如權利要求1-6任一項所述的雙靶向RNA分子在細胞中的毒性驗證方法，其特征在于：將Hep3B細胞按7×103cells/well鋪于96孔細胞培養板中，待細胞貼壁后分別按照50ng/μL、100ng/μL、150ng/μL、200ng/μL的濃度加入到細胞中，每個濃度設置6個復孔，于24h、48h、72h終止處理，進行MTT檢測。
9.如權利要求1-6任一項所述的雙靶向RNA分子沉默肝癌細胞中靶基因的表達，其特征在于：分別將multi-siRNA及PBS加入到Hep3B細胞中，在24h提取細胞RNA，檢測細胞中GP73、hTERT?mRNA、靶蛋白的表達情況。
10.一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向RNA分子的應用，其特征在于：包含有如權利要求1-6任一項所述雙靶向RNA分子的藥物。
...【技術特征摘要】
1.一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法，其特征在于：
3.根據權利要求1或2所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法，其特征在于：所述multi-sirna序列如下：
4.根據權利要求3所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法，其特征在于：multi-sirna能夠插入特定的表達載體中使其在原核生物中表達。
5.根據權利要求4所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法，其特征在于：在multi-sirna的編碼dna序列的上游增加t7啟動子序列，并在序列兩端分別加上內切酶bgl?ii和bpu1102?i的酶切位點，通過化學合成得到相應的dna序列，然后將其插入至原核表達載體pet-28a的bgl?ii和bpu1102?i的位點之間，將其轉化大腸桿菌ht115(de3)，經iptg誘導，可大量合成并在大腸桿菌中積累，能夠大量得到rna分子。
6.根據權利要求5所述的一種能夠防治肝癌藥物多莖環結構的雙靶向rna分子的制備方法，其特征在于：通過誘導轉化帶有multi-sirna質粒的大腸桿菌工程菌，提取大腸桿菌總...
【專利技術屬性】
技術研發人員：金偉波，蔣文沁，劉哲愷，
申請(專利權)人：浙江理工大學紹興生物醫藥研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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