【技術實現步驟摘要】
本申請涉及植物學，具體而言，涉及調節植物體22-nt?sirna產生的基因和應用。
技術介紹
1、小rna(small?rna)是一類廣泛存在于各類真核生物中長度為18～30nt的非編碼rna分子，在轉錄水平、轉錄后水平與翻譯水平調控基因的表達。經過近20年的研究，科學家對小rna的合成以及作用機制等取得了重大的研究成果，多種來源不同、長度不同的小rna在植物體通過不同的方式調控著植物的生長發育與對環境的響應，對小rna作用機制和生物學功能的探索、研究豐富了人們對小rna調控基因表達特異性與復雜性的認識，對于農業生產應用也具有重要的意義。近期的研究表明，在植物中由dcl2蛋白特異產生的長度為22-nt的sirna能夠進行擴增并高效調控植物基因表達與響應外界脅迫。在22-nt?sirna高度富集的植物突變體中，高鹽，aba，干旱，抗病等植物逆境信號被顯著激活，并在植物響應極端氮脅迫過程中發揮重要的作用。然而，在正常植物的生長條件下，由于植物體內負責產生21-nt?sirna的dcl4對dcl2?dsrna底物的競爭等因素的影響，植物內源22-nt?sirna含量很低，因此開發出顯著提高植物22-nt?sirna含量的方法，將是有效提高植物多種逆境適應的途徑。
技術實現思路
1、為了解決上述問題，本申請通過人工基因融合的方法，專利技術了一種在植物體內可有效提高22-nt?sirna產生的方法，因此，本申請的第一目的在于提供一種人工融合的核酸，其構成包括dcl2的基因以及來源于dcl4碳
2、本申請發現當擬南芥中的dcl2融合來源于dcl4碳端包含第二個dsrbd的序列后(命名為dcl2-rbd2)，在植物體內表達該基因能顯著提高22-nt?sirna的含量并增加植物對多種抗性的適應性?；诖耍旧暾堖€發現植物dcl2和dcl4蛋白非常保守，暗示其它植物中的dcl2融合dcl4的dsrbd(dcl2-rbd2)后的蛋白也可能具有與擬南芥中的同源蛋白相同的功能。因此，表達dcl2-rbd2后，能夠顯著提高植物22-nt?sirna的含量與逆境適應性。
3、在其中一個實施例中，植物選自擬南芥、白菜、玉米、小麥、水稻、谷子、大豆、番茄、二穗短柄草、藍星睡蓮、無油樟、江南卷柏、小立碗蘚、地錢等植物中的至少一種。
4、在其中一個實施例中，功能增強的dcl2-rbd2基因需包含以下特征：dcl2基因序列，以及dcl4碳端包含第二個dsrbd的序列。
5、在其中一個實施例中，核酸還包括標簽片段。
6、在其中一個實施例中，標簽片段用于編碼gst，gfp，6his或flag。
7、在其中一個實施例中，表達因子包括dcl2自身啟動子，強啟動子，轉錄激活啟動子和逆境激活啟動子中的至少一種；
8、可選的，自身啟動子為dcl2基因組的序列；
9、可選的，強啟動子選自camv35s、nos、ubq10、actin1中的至少一種；
10、可選的，轉錄激活因子選自dcas9-vp64、dcas9-vp16、dcas9-vpr、dcas9-suntag、dcas9-sam中的至少一種；
11、可選的，逆境激活啟動子選自lea，rd29a，aba2，dreb2a，cor15，prs中的至少一種。
12、本申請的第二目的在于提供一種分離的蛋白，包括dcl2以及融合dcl4的dsrbd后基因編碼的蛋白質。
13、在其中一個實施例中，相比于野生型dcl2蛋白，dcl2-rbd2包括dcl2蛋白的全長以及dcl4的1581后的氨基酸片段。
14、本申請的第三目的在于提供一種核酸構建物，含有上述核酸。
15、在其中一個實施例中，核酸構建物是克隆載體或表達載體。
16、本申請的第四目的在于提供一種宿主細胞，滿足以下特征(1)～(3)中的至少一個：
17、(1)含有相對于該宿主細胞而言為外源的上述核酸；
18、(2)含有上述核酸構建物；
19、(3)表達上述蛋白。
20、在其中一個實施例中，宿主細胞為農桿菌。
21、本申請的第五目的在于提供一種植物細胞或組織或器官，滿足以下特征(1)～(4)中的至少一個：
22、(1)基因組含有上述核酸；
23、(2)含有上述核酸構建物；
24、(3)含有上述宿主細胞；
25、(4)表達上述蛋白；
26、在其中一個實施例中，植物細胞或組織或器官來源于擬南芥、白菜、玉米、小麥、水稻、谷子、大豆、番茄、二穗短柄草、藍星睡蓮、無油樟、江南卷柏、小立碗蘚、地錢等植物中的至少一種。
27、本申請的第六目的在于提供一種構建22nt?sirna表達量增加的轉基因植物的方法，方法包括：
28、(1)提供攜帶dcl2-rbd2基因表達載體的核酸遞送媒介物質；
29、(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的核酸遞送媒介物質接觸，使表達載體所含的核酸轉入植物細胞，并發揮核酸遞送媒介物質對應的dcl2-rbd2表達功能；
30、(3)利用步驟(2)中和核酸遞送媒介物質接觸后的植物細胞或組織/器官產生新生植物材料，篩選表達dcl2-rbd2的新生植物材料；
31、(4)將新生植物材料進一步培養成植株以獲得22-nt?srna表達量升高的轉基因植株。
32、在其中一個實施例中，轉基因植物選自擬南芥、白菜、玉米、小麥、水稻、谷子、大豆、番茄、二穗短柄草、藍星睡蓮、無油樟、江南卷柏、小立碗蘚、地錢等植物中的至少一種。
33、本申請的第七目的在于提供上述轉基因植物在調節植物生長發育和植物脅迫響應中的用途。
34、在其中一個實施例中，植物生長發育活動包括種子萌發、組織和/或器官生長、開花、果實成熟、器官衰老、葉片脫落、花蕾脫落、芽脫落、莢殼脫落、果實脫落中的至少一種；
35、植物脅迫響應包括植物對昆蟲、細菌、真菌、病毒的中的至少一種的生物脅迫反應和/或對種植密度、熱、低溫、干旱、水澇、鹽堿脅迫中的至少一種的非生物學脅迫反應。
36、本申請的第八目的在于提供升高植物dcl2-rbd2基因表達水平的試劑和/或抑制或激活植物dcl2-rbd2蛋白活性的試劑在制備調節植物體22-nt?sirna含量、調節植物體逆境反應敏感性或者制備逆境抗性升高的植物中的用途。
37、在其中一個實施例中，抑制或激活植物dcl2-rbd2蛋白活性的試劑包括化學抑制劑或化學激動劑；和/或
38、升高植物dcl2-rbd2基因表達水平的制劑包括dcl2-rbd2基因過表達載體、dcl2-rbd2?mrna納米遞送復本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.人工融合的核酸，其特征在于，包括DCL2基因的序列、DCL4基因序列及其碳端包含第二個dsRBD序列RBD2，相較于野生型DCL2基因，所述人工融合核酸包含DCL2-RBD2以及用于表達DCL2-RBD2基因的植物表達因子，所述DCL2和DCL4基因來源于植物。
2.根據權利要求1所述的核酸，其特征在于，所述植物選自擬南芥、白菜、玉米、小麥、水稻、谷子、大豆、番茄、二穗短柄草、藍星睡蓮、無油樟、江南卷柏、小立碗蘚、地錢等植物中的至少一種。
3.根據權利要求1所述的核酸，其特征在于，所述表達因子包括基因啟動子，強啟動子，逆境誘導啟動子和轉錄激活因子中的至少一種；
4.分離的蛋白，其特征在于，包括功能增強的DCL2-RBD2重組融合蛋白，所述DCL2-RBD2重組融合蛋白由權利要求1、2中任一項所述的核酸編碼。
5.核酸構建物，其特征在于，含有權利要求1～3中任一項所述的核酸。
6.根據權利要求5所述的核酸構建物，其特征在于，所述核酸構建物是克隆載體或表達載體。
7.宿主細胞，其特征在于，滿足以下特征(1)～
8.根據權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為農桿菌。
9.植物細胞或組織或器官，其特征在于，滿足以下特征(1)～(5)中的至少一個：
10.一種構建顯著積累內源22-nt?siRNA含量的轉基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括：
11.根據權利要求10所述的方法制備的轉基因植物在調節植物生長發育和植物脅迫響應中的用途。
12.提高植物DCL2-RBD2基因表達水平的試劑和/或抑制或激活植物DCL2-RBD2蛋白活性的試劑在制備調節植物體內源22-nt?siRNA含量和/或逆境適應性制劑中的用途。
13.根據權利要求12所述的用途，其特征在于，所述抑制或激活植物DCL2-RBD2蛋白活性的制劑包括改變DCL2-RBD2蛋白活性的化學抑制劑或激動劑；和/或提高植物DCL2-RBD2基因表達水平的制劑包括DCL2-RBD2基因過表達載體、DCL2-RBD2?mRNA納米遞送復合物以及激活DCL2-RBD2基因表達化學激動劑中的至少一種。
14.一種制備內源22-nt?siRNA顯著積累植物的方法，包括正常表達，逆境誘導表達和過表達DCL2-RBD2以制備22-nt?siRNA含量增高的植物。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于，在植物中正常表達DCL2-RBD2，具體為：使用DCL2基因自身啟動子驅動表達；和/或
16.根據權利要求12或13所述的用途、權利要求14～15任一項所述的方法，其特征在于，受控的內源22-nt?siRNA選自下組：種子萌發、組織和器官生長、開花、果實成熟、器官衰老、葉片脫落、花蕾脫落、芽脫落、莢殼脫落、果實脫落、對昆蟲、細菌、真菌、病毒中的至少一種的生物脅迫反應以及對種植密度、熱、低溫、干旱、水澇、鹽堿脅迫中的至少一種的非生物學脅迫反應。
17.根據權利要求9所述的植物細胞或組織或器官、權利要求12或13所述的用途或者權利要求10、14～16中任一項所述的方法，其特征在于，所述植物選自擬南芥、白菜、玉米、小麥、水稻、谷子、大豆、番茄、二穗短柄草、藍星睡蓮、無油樟、江南卷柏、小立碗蘚、地錢等植物中的至少一種。
18.根據權利要求9所述的植物細胞或組織或器官、權利要求12或13所述的用途或者權利要求10、14～16中任一項所述的方法，其特征在于，所述植物為擬南芥，表達的核酸為DCL2-RBD2，包含DCL2基因和來源于DCL4的碳端包含第二個dsRBD2的序列。
...【技術特征摘要】
1.人工融合的核酸，其特征在于，包括dcl2基因的序列、dcl4基因序列及其碳端包含第二個dsrbd序列rbd2，相較于野生型dcl2基因，所述人工融合核酸包含dcl2-rbd2以及用于表達dcl2-rbd2基因的植物表達因子，所述dcl2和dcl4基因來源于植物。
2.根據權利要求1所述的核酸，其特征在于，所述植物選自擬南芥、白菜、玉米、小麥、水稻、谷子、大豆、番茄、二穗短柄草、藍星睡蓮、無油樟、江南卷柏、小立碗蘚、地錢等植物中的至少一種。
3.根據權利要求1所述的核酸，其特征在于，所述表達因子包括基因啟動子，強啟動子，逆境誘導啟動子和轉錄激活因子中的至少一種；
4.分離的蛋白，其特征在于，包括功能增強的dcl2-rbd2重組融合蛋白，所述dcl2-rbd2重組融合蛋白由權利要求1、2中任一項所述的核酸編碼。
5.核酸構建物，其特征在于，含有權利要求1～3中任一項所述的核酸。
6.根據權利要求5所述的核酸構建物，其特征在于，所述核酸構建物是克隆載體或表達載體。
7.宿主細胞，其特征在于，滿足以下特征(1)～(3)中的至少一個：
8.根據權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為農桿菌。
9.植物細胞或組織或器官，其特征在于，滿足以下特征(1)～(5)中的至少一個：
10.一種構建顯著積累內源22-nt?sirna含量的轉基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括：
11.根據權利要求10所述的方法制備的轉基因植物在調節植物生長發育和植物脅迫響應中的用途。
12.提高植物dcl2-rbd2基因表達水平的試劑和/或抑制或激活植物dcl2-rbd2蛋白活性的試劑在制備調節植物體內源22-nt?sirna含量和/或逆境適應性制劑中的用途。...
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。