【技術實現步驟摘要】
本專利涉及分子生物學、遺傳工程和工業發酵，具體涉及一種通過遺傳改造和馴化選育得到的重組大腸桿菌菌株，該菌株能夠有效地利用纖維二糖做為碳源進行生長。
技術介紹
1、纖維二糖是纖維素降解的主要產物之一，它是由兩個葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的二糖。在生物質能源和生物基材料的生產過程中，纖維素的水解是關鍵步驟，而纖維二糖的利用效率直接影響整個生物轉化過程的經濟性和可持續性。傳統大腸桿菌在利用這些原料時，對纖維二糖的親和力較低以及存在其他易利用的碳源（如葡萄糖），導致效率較低且過程復雜。因此，開發能夠高效利用纖維二糖的重組菌株，是實現“烴經濟”到“糖經濟”的關鍵。
2、纖維素酶解后產生的葡萄糖可以被微生物利用，但更具有挑戰性的是利用纖維素酶解產生的其他糖類，如纖維二糖、木糖和阿拉伯糖（intracellular?cellobiosemetabolism?and?its?applications?in?lignocellulose-based?biorefineries,bioresour?technol,?2017,?239:?496-506.）。這些糖類的利用效率直接影響到整個生物轉化過程的經濟性和可持續性。escherichia?coli（大腸桿菌）作為一種工業生產宿主，具有快速生長和高效代謝的特點，但其天然菌株并不能有效利用纖維素衍生的糖類（newinsights?into?transport?capability?of?sugars?and?its?impact?on?growth?fromnovel?m
3、為了克服這些限制，本專利技術選擇了對纖維二糖磷酸化酶的表達進行調控。將纖維二糖磷酸化酶基因cela通過啟動子pldha和終止子tldha克隆至質粒pmd19中，獲得重組質粒pmd19-pldha-cela-tldha，并將重組質粒pmd19-pldha-cela-tldha轉化至上述大腸桿菌菌株宿主中過表達纖維二糖利用的關鍵酶編碼基因，并完成馴化，使菌株的生長速率提升了66.67-83.33%。實現在以纖維質為原料（或纖維二糖為唯一碳源）時，重組菌株可以利用纖維二糖生長且od600達到1.62-2.89左右。在此基礎上，迭代馴化菌株提高纖維二糖的利用效率，使纖維二糖最大限度的被大腸桿菌利用od600最高可達6.27，發酵階段纖維二糖的利用率在98％以上,馴化成功率在93.33%以上，從而在生物質能源和生物基材料的生產中實現更高效和可持續的轉化過程。
技術實現思路
1、本專利技術目的是一種大腸桿菌高效利用纖維二糖重組菌馴化選育的方法，將大腸桿菌（escherichia?coli）改造為能夠直接代謝利用纖維二糖（cellobiose）作為碳源，并通過馴化選育途徑提升纖維二糖的利用效率。
2、為實現上述目的，本專利技術公開了如下的
技術實現思路
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3、一種利用纖維二糖的重組大腸桿菌菌株的選育方法，其特征在于所述重組菌株為攜帶重組質粒pmd19-pldha-cela-tldha的大腸桿菌，所述菌株是將來自天然纖維素分解細菌的纖維二糖磷酸化酶基因cela，核苷酸序列如seq?id?no.1所示，氨基酸序列如seq?idno.2所示，克隆入pmd19-pldha-tldha質粒的啟動子下游和終止上游，并在大腸桿菌中表達包括但不限于大腸桿菌w3110，k12，mg1655，以及其他用于發酵生產的大腸桿菌菌種。
4、按如下的步驟進行：
5、a.以大腸桿菌為出發菌株，通過電擊轉化或化學轉化，將重組質粒pmd19-pldha-cela-tldha轉入出發菌株中；
6、b.菌懸液制備：含有質粒pmd19-pldha-cela-tldha的大腸桿菌單菌落接種到1~2瓶滅菌后的lb培養基中，在30~37℃，150~200r/min條件下持續進行活化培養8~12?h，得到初步活化的菌懸液，將所述初步活化的菌懸液置于離心機中離心處理，棄去上清液得到菌體液，用無機鹽培養基或超純水洗滌菌體液，重復所述離心和洗滌步驟三次后，將菌體液置于2~3瓶無機鹽培養基中，額外補充所需的微量元素及3~5?g/l纖維二糖碳源，并將菌體液的od600值調整到0.050，在30~37℃，150~200?r/min條件下持續進行活化培養；
7、c.梯度馴化：將所述的一次菌懸液進行轉接：取1份一次菌懸液，轉接到2~3瓶不包含碳源的無機鹽培養基中，向所述無機鹽培養基中添加5~8?g/l纖維二糖溶液，在33~37℃，180~200r/min條件下持續攪拌進行馴化培養1周，得到二次菌懸液；
8、d.重復步驟b、c的轉接操作五次，并使每次轉接后培養溫度分別對應為28、30、37、42℃，當最后一次轉接完成后選取菌體密度最好的一組繼續馴化培養24?h，得到含有質粒pmd19-pldha-cela-tldha的六次菌懸液，取出1份所述六次菌懸液，將其與體積分數為30%的甘油按體積比1:1混合，于超低溫條件下保存得到馴化成功的重組菌凍干保藏物。其中
9、所述大腸桿菌為w3110，k12，mg1655，或其他用于發酵生產的大腸桿菌。
10、所述無機鹽培養基的組分以及質量濃度分別為：纖維二糖0.5％～1.0％，十二水磷酸氫二鈉0?.5％～2.5％，氯化鈉0.02％～0?.1％，磷酸二氫鉀0.1％～1.0％，氯化銨0.01％～0?.5％；溶劑為去離子水，無機鹽培養基的ph為7.0；所述lb培養基的組分以及質量濃度分別為：5g/l的酵母提取物、10g/l的胰化蛋白胨、10g/l的氯化鈉、1.5g/l的的瓊脂粉，溶劑為超純水，lb培養基的ph為7.0，所述滅菌的溫度為120~125℃，滅菌的時間為20~30min。
11、所述轉接菌懸液的初始od600控制在0.05~0.12，所述馴化的溫度為30~37℃，所述攪拌的轉速為150-200?rpm，所述超低溫的溫度為-80℃。所述的馴化纖維二糖磷酸化酶酶活高于7?u/ml時，馴化成功率較高。所述重懸處理的離心轉速為4000?rpm，離心處理的時間為5min。
12、本專利技術所述的一種胞內表達纖維二糖磷酸化酶（cela）的啟動子和終止子包括但不限于d-乳酸脫氫酶的啟動子（pldha，核苷酸序列如seq?id?no.3）和終止子（tldha，核苷酸序列如seq?id?no.4）。
13、本專利技術更進一步公開了馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育的方法在用于提升纖維二糖利用效率方面的應用。實驗結果顯示經過馴化的大腸桿菌重組菌株在纖維二糖利用效率方面有顯著提升。與未馴化的菌株相比，馴化菌株在發酵實驗中表現出更高的底物轉化率。這一結果表明，馴化過程有效增強了菌株對纖維二糖的代謝能力，優化了其發酵特性。
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【技術保護點】
1.一種利用纖維二糖的重組大腸桿菌菌株的選育方法，其特征在于所述重組菌株為攜帶重組質粒pMD19-PldhA-celA-TldhA的大腸桿菌，所述菌株是將來自天然纖維素分解細菌的纖維二糖磷酸化酶基因celA，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ?IDNO.2；克隆入pMD19-PldhA-TldhA質粒的啟動子下游和終止子上游，并在大腸桿菌中表達包括但不限于大腸桿菌W3110，K12，MG1655，以及其他用于發酵生產的大腸桿菌菌種。
2.一種胞內表達纖維二糖磷酸化酶（CelA）的啟動子和終止子包括但不限于D-乳酸脫氫酶的啟動子（PldhA，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3）和終止子（TldhA，核苷酸序列如SEQ?IDNO.4）。
3.權利要求1所述一種利用纖維二糖的重組大腸桿菌菌株的選育方法，其特征在于按如下的步驟進行：
4.權利要求1所述的一種馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為W3110，K12，MG1655，或其他用于發酵生產的大腸桿菌。
5.權利要求3所述的一種馴化的
6.權利要求3所述的一種馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育的方法，其特征在于，所述轉接菌懸液的初始OD600控制在0.05~0.12，所述馴化的溫度為30~37℃，所述攪拌的轉速為150-200?rpm，所述超低溫的溫度為-80℃。
7.權利要求3所述的一種馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育的方法，其特征在于，所述的馴化纖維二糖磷酸化酶酶活高于7?U/mL時，馴化成功率較高。
8.權利要求3所述的一種馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育的方法，其特征在于，所述重懸處理的離心轉速為4000?rpm，離心處理的時間為5min。
9.權利要求1所述馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育方法在用于提升纖維二糖利用效率方面的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種利用纖維二糖的重組大腸桿菌菌株的選育方法，其特征在于所述重組菌株為攜帶重組質粒pmd19-pldha-cela-tldha的大腸桿菌，所述菌株是將來自天然纖維素分解細菌的纖維二糖磷酸化酶基因cela，核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其氨基酸序列如seq?idno.2；克隆入pmd19-pldha-tldha質粒的啟動子下游和終止子上游，并在大腸桿菌中表達包括但不限于大腸桿菌w3110，k12，mg1655，以及其他用于發酵生產的大腸桿菌菌種。
2.一種胞內表達纖維二糖磷酸化酶（cela）的啟動子和終止子包括但不限于d-乳酸脫氫酶的啟動子（pldha，核苷酸序列如seq?id?no.3）和終止子（tldha，核苷酸序列如seq?idno.4）。
3.權利要求1所述一種利用纖維二糖的重組大腸桿菌菌株的選育方法，其特征在于按如下的步驟進行：
4.權利要求1所述的一種馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為w3110，k12，mg1655，或其他用于發酵生產的大腸桿菌。
5.權利要求3所述的一種馴化的大腸桿菌重組菌株馴化選育的方法，其特征在于，所述無機鹽培養基的組分以及質量濃度分別為：纖維...
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