【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥，具體涉及一種抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽及其制備方法和應用，更具體涉及一種能與hpv?l1蛋白結合的重組iii型人源膠原蛋白肽及其在制備預防和/或治療hpv感染的藥物中的用途。
技術介紹
1、人乳頭瘤病毒（hpv）是一種表皮及黏膜鱗狀上皮易感的環狀dna病毒。我國不同地區健康女性hpv感染率為15%-28%，hpv持續感染是宮頸癌的主要病因，其中70%-84%的宮頸癌發病與hpv?16、18型感染相關。除接種疫苗預防手段外，目前尚無特效藥物。現有治療主要通過物理治療及干擾素等輔助治療，難以解決亞臨床及持續感染的問題，造成治標不治本，易于復發。對于無法自我清除的高危型hpv感染患者，阻斷病毒的持續性感染，降低病毒載量負荷，進而防止宮頸病變有著重要意義。人源iii型膠原蛋白在人體組織中廣泛存在，并起著重要的結構和功能作用，它主要分布在皮膚、血管、肌肉、腸道黏膜、器官的外膜等處。外源性補充活性人源iii型膠原蛋白，能起到對陰道的滋潤和保濕作用，恢復陰道粘膜的正常組織功能和陰道彈性，有助于維持宮頸的正常功能。
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽及其制備方法和應用，更具體涉及一種能與hpvl1蛋白結合的重組iii型人源膠原蛋白肽及其在制備預防和/或治療hpv感染的藥物中的用途。
2、本專利技術由如下技術方案實現的，一種抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽，其氨基酸序列為iii型人源膠原蛋白第991
3、本專利技術還提供了如上所述的抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽的編碼基因，該編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.2所示。
4、本專利技術還提供了制備所述抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽的方法，包括如下步驟：
5、（1）培養：將iii型人源膠原蛋白第991位-1032位編碼序列uniprotkb：p02461進行三個重復，命名為athpv3；將該序列的3’端連組氨酸標簽以及翻譯終止密碼子tga，通過限制性內切酶位點ecori和xhoi，構建入pcaggs載體中，轉染至hek?293f細胞中進行真核表達，收集293f細胞培養后的上清；
6、（2）洗脫：采用histrap?hp?5?ml親和層析柱純化目的蛋白，在含ph?8.0、20?mmtris、150?mm?nacl和300?mm咪唑的洗脫緩沖液中洗脫；
7、（3）純化：在含ph?8.0、20?mm?tris和150?mm?nacl的緩沖液中，使用hiload?16/600?superdex?75?prep凝膠過濾層析柱，以1ml/min的流速進行純化；純化后的蛋白經sds-page鑒定，分子量大小為13kd即為目標膠原蛋白肽。
8、本專利技術還提供了所述抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽在制備預防和/或治療hpv感染的藥物中的用途。
9、進一步的，所述重組iii型人源膠原蛋白肽athpv3與hpv?16/18?l1蛋白結合，親和力分別為51.6?nm，58.2?nm。
10、更進一步的，所述重組iii型人源膠原蛋白肽athpv3與hpv16?l1形成5對氫鍵，與hpv18?l1形成4對氫鍵。
11、本專利技術以人源iii型膠原蛋白序列為基礎，進行截短、改造，設計了一種能與hpvl1蛋白結合的重組蛋白肽athpv3，然后將其轉染至適用于hek?293f細胞表達的質粒中，用于生產重組iii型人源膠原蛋白肽。spr法檢測重組iii型人源膠原蛋白肽與hpv?16/18?l1蛋白親和力；分子對接證明兩蛋白相互作用力；熒光素酶報告基因實驗檢測重組iii型人源膠原蛋白肽對hpv?16/18假病毒的中和活性。
12、結果顯示：經表達、純化，獲得分子量約為13?kd的重組iii型人源膠原蛋白肽，相較于基礎序列的八個重復（約30?kd）、十個重復（約40?kd）而言，由于其較小的分子量，可以更好地進入的靶點所在蛋白結構域；親和力結果表明athpv3可與hpv?16/18?l1蛋白有效的結合，且特異性較高；athpv3與hpv?16/18?l1蛋白存在多對氫鍵作用；高、中濃度athpv3均能抑制假病毒感染293t細胞。對于機體而言，本專利技術所制備的膠原蛋白肽可通過與hpv?l1結合來抑制hpv入侵靶細胞，阻止病毒復制，降低病毒量，從而阻斷病毒持續性感染，達到防治hpv所引發的宮頸癌等疾病。
13、本專利技術所制備的athpv3具有顯著地抗hpv活性，為治療宮頸癌等hpv感染疾病提供了一種有效方法。本專利技術成功獲得一種純度較好、可與hpv?16/18?l1結合、且能有效抑制hpv?16/18假病毒感染293t細胞的重組iii型人源膠原蛋白肽athpv3，為防治hpv感染提供了有效的候選藥物。
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1.一種抗HPV感染的重組III型人源膠原蛋白肽，其特征在于：其氨基酸序列為III型人源膠原蛋白第991位-1032位編碼序列UniProtKB：P02461進行三個重復，命名為ATHPV3，具體氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.如權利要求1所述的抗HPV感染的重組III型人源膠原蛋白肽的編碼基因，其特征在于：該編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2所示。
3.制備權利要求1所述抗HPV感染的重組III型人源膠原蛋白肽的方法，其特征在于：包括如下步驟：
4.權利要求1所述抗HPV感染的重組III型人源膠原蛋白肽在制備預防和/或治療HPV感染的藥物中的用途。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：所述重組III型人源膠原蛋白肽ATHPV3與HPV?16/18?L1蛋白結合，親和力分別為51.6?nM，58.2?nM。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述重組III型人源膠原蛋白肽ATHPV3與HPV16?L1形成5對氫鍵，與HPV18?L1形成4對氫鍵。
【技術特征摘要】
1.一種抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽，其特征在于：其氨基酸序列為iii型人源膠原蛋白第991位-1032位編碼序列uniprotkb：p02461進行三個重復，命名為athpv3，具體氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2.如權利要求1所述的抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽的編碼基因，其特征在于：該編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.2所示。
3.制備權利要求1所述抗hpv感染的重組iii型人源膠原蛋白肽的方法，其特征...
【專利技術屬性】
技術研發人員：白崇智，王若瑜，楊鈐，仝立國，吉海杰，仲啟明，王舒，宋美卿，李婷鈺，鄭晨，高炎，
申請(專利權)人：山西省中醫藥研究院山西省中醫院，
類型：發明
國別省市：
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