【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體的制備方法及tcep或其鹽的用途。具體地，本專利技術涉及一種用于制備具有改進均一性的adc的生物偶聯過程。
技術介紹
1、本節中的陳述僅提供與本專利技術相關的背景信息，并不一定構成現有技術。
2、抗體藥物偶聯物(adc)是具有硫醇基團修飾的抗體，其中利用連接子將抗體與小分子藥物連接。通過將強效的細胞毒性藥物遞送至表達抗原的細胞，adc理想地結合了抗體的特異性和細胞毒性藥物的高效力，從而增強其靶向細胞毒性活性。與傳統化療藥物相比，adc僅靶向表達抗原的癌細胞，因此健康細胞受到的影響較小(pettinato,mark?c.(2021)“introduction?to?antibody-drug?conjugates.”(抗體藥物偶聯物簡介)《抗體》(mab)(瑞士巴塞爾)10(42):42-52,joubert?n,beck?a,dumontet?c,denevault-sabourin?c.(2020)“antibody-drug?conjugates:the?last?decade.”(抗體藥物偶聯物：過去十年的發展)《藥物》(pharmaceuticals)(巴塞爾)。13(9):245-275.)。在多個疾病領域，尤其是在癌癥領域，adc有著廣泛的潛在治療應用，成為一種用于疾病治療的新型靶向藥物。自2000年麥羅塔(mylotarg)獲批以來，迄今已有14種adc藥物獲得了美國食品藥品管理局的批準。
3、對于adc的藥物附著，使用對抗體和連接子-有效載
4、已經開發出許多方法來提高adc的均一性。例如，synaffix已開發出glycoconnecttm技術(us2015/0320882,synaffix.com/platform/technology/)，通過三步過程(酶消化、酶介導的連接和非金屬點擊化學)修飾天然抗體聚糖，將抗體轉化為dar2、dar4或dar1和dar6型穩定偶聯adc。然而，該技術存在許多缺點，包括但不限于成本高、操作復雜、fc功能喪失。
5、us20210128743揭示了一種利用微生物轉谷氨酰胺酶(mtg)生成adc的方法。該方法包括以下步驟：將具有伯胺殘基的連接子與抗體重鏈或輕鏈中包含的gln殘基(在大多數情況下為igg1抗體中的n295)偶聯。除了與使用酶催化相關聯的缺點之外，由于n295與n297鄰近，該修飾將會嚴重影響fc功能，諸如adcc、adcp和cdc。(jeger?s、zimmermann?k、blanca等人。site-specific?and?stoichiometric?modification?of?antibodies?bybacterial?transglutaminase(細菌轉谷氨酰胺酶對抗體的位點特異性化學計量修飾)。《德國應用化學》(angew?chem?int?ed?engl.)。2010年12月17日；49(51):9995-7.)而且，由于使用連接酶，至少需要一步層析法純化。
6、pclick(us20210130395)和abylink(wo2021/110860)兩者均利用fc親和肽，通過鄰近促進連接來安裝賴氨酸反應性連接子-有效載荷，從而生成dar2型抗體偶聯物。與硫醇修飾相反，賴氨酸修飾會消耗抗體的表面電荷殘基，因此可改變內在構象并影響抗體的穩定性。除此之外，fc親和肽指向的偶聯位點與fc受體結合域接近或部分重疊，因此將導致fc功能至少出現部分損失。
7、因此，開發能夠生成具有改進均一性的adc的新型生物偶聯方法的需求持續存在。
技術實現思路
1、本專利技術開發了一種具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體的制備方法及tcep或其鹽的用途。利用該抗體的硫醇基團位點特異性修飾，本專利技術提供了多種高均一性的adc，諸如d2型adc、d1型adc、d2+d6型adc、d2+d3型adc、d1+d6型adc、d1+d3型adc、d0+d6型adc、d0+d3型adc、d2+d2型adc、d2+d4型adc、d1+d4型adc或d1+d2型adc。與常規偶聯過程相比，d2型adc均一性達到55％、60％、65％，甚至達到70％、75％、80％或83％。同時，該方法操作簡單并且成本更低，無需酶工程和聚糖修飾。通過本專利技術的方法生成的具有改進均一性的adc還具有優化的安全性和有效性。
2、一方面，本專利技術提供了一種具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體的制備方法，其特征在于，從該抗體內的鏈間二硫鍵還原硫醇基團，并且該方法包括使用三(2-羧乙基)膦(tcep)或其鹽以及過渡金屬離子，其中，tcep與該過渡金屬離子的摩爾比為1:0.4至1:200。
3、第二方面，本專利技術提供了一種通過本專利技術的方法制備的具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體。
4、第三方面，本專利技術提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含根據本專利技術的具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體以及一種或多種藥學上可接受的載體。
5、第四方面，本專利技術提供了tcep或其鹽在制備根據本專利技術的具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體中的用途。
6、第五方面，本專利技術提供了根據本專利技術的具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體在生產用于診斷、預防或治療疾病的治療劑中的用途。
7、第六方面，本專利技術提供了一種在有需要的受試者中預防或治療疾病的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的根據本專利技術的具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體。
8、本專利技術中，tcep與過渡金屬離子以特定摩爾比選擇性地還原抗體內的四個鏈間二硫鍵之一。在步驟(b)中，修飾試劑1附著在抗體的還原硫醇基團上。在步驟(c)中不引入過渡金屬離子的情況下，引本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體的制備方法，其特征在于，從所述抗體內的鏈間二硫鍵還原產生硫醇基團，并且所述方法包括使用三(2-羧乙基)膦TCEP或其鹽以及過渡金屬離子，其中，TCEP與所述過渡金屬離子的摩爾比為1:0.4至1:200。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫醇基團的數目為1、2、3、4、5、6、7或8。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述鏈間二硫鍵在鉸鏈區上部連接兩條重鏈，或者在Fab區中將重鏈連接到輕鏈。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述鏈間二硫鍵在鉸鏈區中連接兩條重鏈，并且在Fab區中將重鏈連接到輕鏈。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
7.根據權利要求5至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一硫橋試劑和所述第二硫橋試劑各自獨立地含有允許對所述硫醇基團進行重新橋接的至少兩個取代基。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述反應性基團各自獨立地含有疊氮基和/或二苯并環辛炔DBCO。
10.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，TCEP與所述過渡金屬離子的摩爾比為1:2至1:70，可選地，TCEP與所述金屬過渡離子的摩爾比為1:12。
11.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗體與TCEP的摩爾比為1:1至1:3。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗體與TCEP的摩爾比為1:1至1:2，可選地，所述抗體與TCEP的摩爾比為0.6:1。
13.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系各自獨立地選自由以下各項組成的組：HEPES緩沖液、組氨酸緩沖液、PBS、MES緩沖液、BES緩沖液、MOPS緩沖液、Bis-Tris緩沖液、乙酸鹽緩沖液、DIPSO緩沖液、MOPSO緩沖液、TES緩沖液、ACES緩沖液、TAPSO緩沖液、PIPES緩沖液、BTP緩沖液、HEPPSO緩沖液、POPSO緩沖液、EPPS緩沖液和Tris緩沖液。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系各自獨立地選自由以下各項組成的組：Bis-Tris緩沖液、MOPS緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液、PIPES緩沖液、DIPSO緩沖液、MOPSO緩沖液、TES緩沖液和BES緩沖液。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系各自獨立地選自由以下各項組成的組：Bis-Tris緩沖液、MOPS緩沖液、HEPES緩沖液、BES緩沖液、PIPES緩沖液和MES緩沖液。
16.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系的pH值為5.5至8。
17.根據權利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系的pH值為5.8至7.4，優選地，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系的pH值為6.7至7.4。
18.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述過渡金屬離子選自由以下各項組成的組：Zn2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+及其組合。
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于，所述過渡金屬離子為Zn2+。
20.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，孵育溫度為0℃至37℃、0℃至25℃或0℃至15℃，在步驟(a)中，孵育時間為0.5h至24h。
21.根據權利要求20所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述孵育溫度為4℃至24℃，并且所述孵育時間為2h至16h。
22.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗體與TCEP的摩爾比為1:3，并且孵育時間為1h至5h。
23.根據權利要求6所述的方法，在步驟(c)中，所述第二還原劑與所述過渡金屬離子的摩爾比為1:0.05至1:40，和/或所述抗體與所述第二還原劑的摩爾比為1:2.5至1:20，和/或孵育時間為1h至24h。
24.根據權利要求6所述的方法，在步驟(c)中，所述第二還原劑與所述過渡金屬離子的摩爾比為1:0.4至1:100，和/或所述抗體與所述第二還原劑的摩爾比為1:0.8至1:2.5，和/或孵育時間為0.5h至24h。
25.根據權利要求5所...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種具有硫醇基團位點特異性修飾的抗體的制備方法，其特征在于，從所述抗體內的鏈間二硫鍵還原產生硫醇基團，并且所述方法包括使用三(2-羧乙基)膦tcep或其鹽以及過渡金屬離子，其中，tcep與所述過渡金屬離子的摩爾比為1:0.4至1:200。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫醇基團的數目為1、2、3、4、5、6、7或8。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述鏈間二硫鍵在鉸鏈區上部連接兩條重鏈，或者在fab區中將重鏈連接到輕鏈。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述鏈間二硫鍵在鉸鏈區中連接兩條重鏈，并且在fab區中將重鏈連接到輕鏈。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
7.根據權利要求5至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一硫橋試劑和所述第二硫橋試劑各自獨立地含有允許對所述硫醇基團進行重新橋接的至少兩個取代基。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一硫橋試劑和所述第二硫橋試劑各自獨立地選自由以下各項組成的組：
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述反應性基團各自獨立地含有疊氮基和/或二苯并環辛炔dbco。
10.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，tcep與所述過渡金屬離子的摩爾比為1:2至1:70，可選地，tcep與所述金屬過渡離子的摩爾比為1:12。
11.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗體與tcep的摩爾比為1:1至1:3。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗體與tcep的摩爾比為1:1至1:2，可選地，所述抗體與tcep的摩爾比為0.6:1。
13.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系各自獨立地選自由以下各項組成的組：hepes緩沖液、組氨酸緩沖液、pbs、mes緩沖液、bes緩沖液、mops緩沖液、bis-tris緩沖液、乙酸鹽緩沖液、dipso緩沖液、mopso緩沖液、tes緩沖液、aces緩沖液、tapso緩沖液、pipes緩沖液、btp緩沖液、heppso緩沖液、popso緩沖液、epps緩沖液和tris緩沖液。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系各自獨立地選自由以下各項組成的組：bis-tris緩沖液、mops緩沖液、mes緩沖液、hepes緩沖液、pipes緩沖液、dipso緩沖液、mopso緩沖液、tes緩沖液和bes緩沖液。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系各自獨立地選自由以下各項組成的組：bis-tris緩沖液、mops緩沖液、hepes緩沖液、bes緩沖液、pipes緩沖液和mes緩沖液。
16.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系的ph值為5.5至8。
17.根據權利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系的ph值為5.8至7.4，優選地，所述第一緩沖體系和所述第二緩沖體系的ph值為6.7至7.4。
18.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述過渡金屬離子選自由以下各項組成的組：zn2+、cd2+、hg2+、ni2+、co2+及其組合。
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于，所述過渡金屬離子為zn2+。
20.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，孵育溫度為0℃至37℃、0℃至25℃或0℃至15℃，在步驟(a)中，孵育時間為0.5h至24h。
21.根據權利要求20所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述孵育溫度為4℃至24℃，并且所述孵育時間為2h至16h。
22.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗體與tcep的摩爾比為1:3，并且孵育...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳麗麗，吉傲，邵雅茹，
申請(專利權)人：蘇州佰睿壹生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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