【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種抑制巨噬細胞泡沫化的短肽快速篩選方法，屬于生物醫藥。
技術介紹
1、巨噬細胞泡沫化是動脈粥樣硬化心血管疾病形成的重要標志，抑制巨噬細胞泡沫化是治療心血管疾病的重要靶點。目前對于抑制巨噬細胞泡沫化的藥物并沒有科學高效的篩選方法，現有的藥物篩選方法主要是油紅o染色拍照和膽固醇含量檢測檢測，但是這些方法不能避免的都有細胞用量大，耗材消耗大，費用貴的問題。并且基礎表征的篩選對細胞的干預機制并沒有靶向性。對于藥物干預機制的探究造成一定的困難。
2、虛擬篩選作為一種經濟，快速的計算機輔助藥物設計方式。已經廣泛運用于藥物設計領域。分子對接技術是利用計算機技術研究小分子化合物與蛋白受體的相互作用，并根據結合方式及親和力大小進行打分排序。通過分子對接可以通過很短的時間將待篩選化合物進行打分篩選。對于靶點的選擇應該選擇對巨噬細胞泡沫化有重要調節作用的重要靶點，膜鐵轉運蛋白fpn能夠通過調節肝x受體α(lxrα)的表達從而調節膽固醇流出蛋白的表達從而抑制巨噬細胞泡沫化。因此可以選擇fpn蛋白作為對接靶點。由于虛擬篩選的模擬條件受限制，實驗效果往往達不到預期要求。因此將虛擬篩選結構進行進一步的實驗篩選可有效提高藥物設計成功率。
3、油紅o是一種常見的脂質染料，可以將細胞中積累的脂質進行染色，通過顯微鏡觀察脂質分布情況從而反應藥物的效果。但是油紅o染色細胞通常使用24孔板或者12孔板制樣，存在試劑耗用大，觀察區域主管選擇性強，無法批量實驗的缺陷。尼羅紅是一種能與脂質特異性結合的熒光染料，與熒光強度與脂質含量線性關
技術實現思路
1、針對上述現有技術的不足，本專利技術提供一種抑制巨噬細胞泡沫化的短肽篩選方法，目的在于彌補現在對靶向抑制巨噬細胞泡沫化的藥物的高通量篩選方法的空白，改善了傳統方法耗材消耗高，細胞要求量大，主觀性強的缺點。
2、本專利技術提供的第一個技術方案為一種抑制巨噬細胞泡沫化的短肽篩選方法，包括如下步驟：
3、s1，分子對接篩選：
4、通過discovery?studio軟件將黑豆源脂溶性短肽數據庫中短肽與巨噬細胞中關鍵蛋白進行lib-dock分子對接，進行打分，獲得初篩短肽；
5、s2，尼羅紅染色篩選：
6、將步驟s1中的初篩短肽與泡沫細胞混合，利用尼羅紅檢測泡沫細胞的脂質含量，獲得復篩短肽；
7、s3，ce/tc定量篩選和油紅o染色驗證：
8、將步驟s2的復篩短肽進行ce/tc檢測和油紅o染色，進而排除尼羅紅篩選實驗中由于細胞鋪板不均勻而產生的假陽性，從而最終確定篩選藥物的作用，獲得抑制巨噬細胞泡沫化的短肽。
9、在某些實施方式中，步驟s1具體包括以下步驟：
10、s11數據庫準備：在黑豆蛋白水解液中選擇80～200條氨基酸殘基數為2-9個，gravy值大于0的脂溶性短肽作為待篩選數據庫；
11、s12脂溶性短肽結構準備：利用pymol創建步驟s11中數據庫的肽段結構；
12、s13對接蛋白受體選擇：選擇調節巨噬細胞泡沫化的關鍵蛋白fpn進行對接；
13、s14分子對接：a.受體蛋白準備：移除小分子配體、加氫、定義和編輯步驟s13中的蛋白對接位點；b.配體準備：導入步驟s12中的肽段結構，生成構型，能量最小化處理；
14、s15虛擬篩選：將步驟s14中的配體與受體進行批量對接計算，取對接結果打分較高的20～50條短肽，即為初篩短肽。
15、在某些實施方式中，步驟s2具體包括以下步驟：
16、s21細胞培養：將thp-1細胞接入完全培養基培養至細胞密度達到80～90％；
17、s22細胞誘導：600～800r/min收集步驟s21培養的細胞，用完全培養基將細胞密度調整為6x105～106/ml的均勻細胞懸液，并加入在完全培養基中加入佛波酯終濃度為100ng/ml，將細胞懸液培養24h～72h誘導為巨噬細胞，待細胞貼壁，并且伸出偽足；
18、s23加藥培養：向步驟s22中培養的細胞中加入步驟s1中的初篩短肽共同培養；
19、s24尼羅紅染色：取出細胞吸去培養基，pbs溶液洗兩遍，加4％多聚甲醛固定10～20min，再用pbs溶液洗兩遍，加尼羅紅試劑染色10～20min，在用pbs洗兩遍；
20、s25數值檢測：熒光酶標儀ex/em＝552/636nm檢測數值反應細胞中脂質積累程度，獲得復篩短肽。
21、在某些實施方式中，步驟s3具體包括以下步驟：
22、s31細胞培養與誘導：將泡沫細胞接入完全培養基培養至細胞密度達到80～90％；600～800r/min收集步驟s21培養的細胞，用完全培養基將細胞密度調整為6×105～106/ml的均勻細胞懸液，并加入在完全培養基中加入佛波酯終濃度為100ng/ml，將細胞懸液培養24h～72h誘導為巨噬細胞，待細胞貼壁，并且伸出偽足；
23、s32細胞裂解：約500萬個細胞加入100～150μl裂解液在冰上裂解20～30min，10000～12000r/min，離心5～10min，取上清待測；
24、s33?tc、fc檢測：將分別將tc、fc試劑工作液180μl與步驟s32的細胞上清20μl混合，在37℃水浴20分鐘。用酶標儀在550nm處檢測od值；
25、s34計算：利用步驟s33的od值根據標準曲線分別計算tc、fc、ce獲得抑制巨噬細胞泡沫化的短肽。
26、本專利技術提供的第二個技術方案為第一個技術方案所述的方法在制備用于抑制巨噬細胞泡沫化的產品中的應用，所述產品含有flr和lpsvl中的一種或兩種短肽。
27、本專利技術提供的第三個技術方案為第一個技術方案所述的方法在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的產品中的應用，所述產品含有flr和lpsvl中的一種或兩種短肽。
28、在某些實施方式中，所述產品為藥品或食品。
29、在某些實施方式中，所述藥品同時還含有藥物載體和/或藥用輔料。
30、在某些實施方式中，所述藥物載體包含微囊、微球、納米粒以及脂質體。
31、在某些實施方式中，所述藥用輔料包含賦形劑以及附加劑。
32、在某些實施方式中，所述藥用輔料包含穩定劑、矯味劑、著色劑、填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑中的一種或多種。
33、在某些實施方式中，所述藥品的劑型包含顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。
34、本專利技術提供的第四個技術方案為短肽在制備用于抑制巨噬本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.短肽在制備用于抑制巨噬細胞泡沫化的產品中的應用，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列為FLR或LPSVL。
2.一種FPN蛋白的激活劑，其特征在于，含有FLR和LPSVL中一種或兩種短肽。
3.短肽在在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥品中的應用，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列為FLR或LPSVL。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述藥品同時還含有藥物載體和/或藥用輔料。
5.一種抑制巨噬細胞泡沫化的短肽篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S1具體包括以下步驟：
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S2具體包括以下步驟：
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S3具體包括以下步驟：
9.權利要求5～8任一項所述的方法在制備用于抑制巨噬細胞泡沫化的產品中的應用，其特征在于，所述產品含有FLR和LPSVL中的一種或兩種短肽。
10.權利要求5～8任一項所述的方法在制備預防、緩解和/或治療動脈粥
...【技術特征摘要】
1.短肽在制備用于抑制巨噬細胞泡沫化的產品中的應用，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列為flr或lpsvl。
2.一種fpn蛋白的激活劑，其特征在于，含有flr和lpsvl中一種或兩種短肽。
3.短肽在在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥品中的應用，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列為flr或lpsvl。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述藥品同時還含有藥物載體和/或藥用輔料。
5.一種抑制巨噬細胞泡沫化的短肽篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要...
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