【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及結(jié)構(gòu)生物學(xué)，具體而言，涉及一種用于電鏡和晶體研究的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)構(gòu)建及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、蛋白的結(jié)構(gòu)決定蛋白的功能，蛋白結(jié)構(gòu)的解析不僅有助于揭示生命過程中的復(fù)雜機(jī)制，還可以幫助設(shè)計和改造具有特定功能和特性的蛋白，更好地滿足特定需求。通過解析藥物與靶標(biāo)蛋白之間的相互作用模式，還可以指導(dǎo)藥物的設(shè)計和研發(fā)過程。核酸適配體是從隨機(jī)dna或rna文庫中通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)分離出來的單鏈寡核苷酸，可以折疊成獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)與相應(yīng)靶標(biāo)包括蛋白質(zhì)、離子、甚至整個細(xì)胞高親和力和高特異性結(jié)合。核酸適配體在藥物設(shè)計研發(fā)、和遞送偶聯(lián)應(yīng)用廣泛，研究核酸適配體與蛋白靶標(biāo)的結(jié)合具有重要意義。
2、目前大多數(shù)的核酸適配體蛋白靶標(biāo)是一些分子量中等大小的蛋白，而針對核酸適配體蛋白靶標(biāo)及相互作用模式的研究方法大多限于核磁共振波譜法。由于磁共振技術(shù)僅限于35k?d以下的小蛋白，而且對所研究蛋白在溶液中的穩(wěn)定性要求很高，需要高的純度和濃度且依賴同位素標(biāo)記，很多蛋白難以被解析。從文獻(xiàn)報道來看，相較于核磁共振波譜，其它兩種結(jié)構(gòu)生物學(xué)主流技術(shù)-非常強(qiáng)大的電鏡重構(gòu)技術(shù)和最為經(jīng)典的x射線晶體技術(shù)普遍的應(yīng)用很少。重要的原因是，電鏡技術(shù)需要300kda以上的大蛋白才容易被看到，x射線單晶衍射技術(shù)結(jié)構(gòu)最為清晰，但是能夠長出蛋白晶體是制約該技術(shù)必需的第一步，也是最主要瓶頸問題之一。
3、lrpprc蛋白(leucine-rich?pentatricopeptide?repeat-containing?protein)是由核酸適配體篩選發(fā)
4、鑒于此，特提出本專利技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種能夠用于電鏡和晶體研究的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)方法，構(gòu)建的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)能夠滿足電鏡技術(shù)對蛋白分子量的要求，也能篩出lrpprc蛋白功能域晶體，同時蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)靶蛋白仍然能與核酸適配體相互作用。
2、第一方面，本專利技術(shù)提供了一種用于電鏡和晶體研究的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，其包括內(nèi)殼、外殼以及夾在內(nèi)外殼之間的靶蛋白，內(nèi)殼為鐵蛋白，鐵蛋白包括大腸桿菌來源的鐵蛋白。
3、第二方面，本專利技術(shù)提供了上述蛋白質(zhì)納米雙殼的構(gòu)建方法，其包括：將標(biāo)簽蛋白、靶蛋白和鐵蛋白的基因依次連接的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分離純化后即可獲得蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)。
4、第三方面，本專利技術(shù)提供了上述蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)在電鏡和晶體結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用，包括：
5、將經(jīng)過純化后的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)通過透射電鏡成像進(jìn)行二維重構(gòu)，以確定含有靶蛋白的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)形態(tài)構(gòu)建成功；和/或
6、將經(jīng)過純化后的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)通過過濾、濃縮和篩選后獲得靶蛋白的蛋白晶體。
7、第四方面，本專利技術(shù)還提供了一種融合蛋白，其包含：大腸桿菌來源的鐵蛋白，連接在大腸桿菌來源的鐵蛋白的n端的靶蛋白，以及靶蛋白n端融合表達(dá)的標(biāo)簽蛋白；靶蛋白為lrpprc蛋白；標(biāo)簽蛋白為麥芽糖結(jié)合蛋白。
8、第五方面，本專利技術(shù)還提供了一種載體，其包含用于表達(dá)上述融合蛋白的表達(dá)盒。
9、第六方面，本專利技術(shù)還提供了一種試劑盒，其包含上述蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)、融合蛋白或者載體。
10、本專利技術(shù)具有以下有益效果：
11、本專利技術(shù)通過以大腸桿菌來源的鐵蛋白為內(nèi)殼構(gòu)建了一種用于電鏡和晶體研究的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，該蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)能夠通用于電鏡和晶體結(jié)構(gòu)研究，實(shí)用性強(qiáng)，產(chǎn)生的納米結(jié)構(gòu)能保持靶蛋白與核酸適配體相互作用，適用范圍廣，不僅通用于電鏡、晶體研究，并且具有普適性，適用于與lrpprc蛋白具有相似結(jié)構(gòu)特征(α螺旋結(jié)尾的且能與核酸適配體相互作用)的蛋白區(qū)段。這一以構(gòu)象為基礎(chǔ)進(jìn)行靶蛋白與天然多聚體蛋白融合表達(dá)的思路具有推廣性，可以充分利用到與鐵蛋白類似的自組裝多聚體蛋白，使更多靶點(diǎn)蛋白能夠被電鏡看到或者借助天然多聚體蛋白易結(jié)晶的特性出晶從而可以研究結(jié)構(gòu)，而且這種基于單一構(gòu)象進(jìn)行蛋白重構(gòu)的方法無需突變更加高效。本專利技術(shù)的靶點(diǎn)蛋白為核酸適體靶標(biāo)蛋白，該區(qū)段重構(gòu)后仍然能與核酸適體相互作用。因此，采用本專利技術(shù)提供的方法能夠簡便，高效地產(chǎn)生通用性的用于電鏡和晶體研究并且保持與原有核酸適配體相互作用的融合蛋白，該方法對于蛋白的結(jié)構(gòu)研究、核酸適配體與蛋白相互作用研究、乃至核酸藥物開發(fā)都具有重要的意義，也對蛋白結(jié)構(gòu)研究具有推廣性和啟發(fā)性。
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1.一種用于電鏡和晶體研究的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)包括內(nèi)殼、外殼以及夾在內(nèi)外殼之間的靶蛋白，所述內(nèi)殼為鐵蛋白，所述鐵蛋白包括大腸桿菌來源的鐵蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述靶蛋白為α螺旋結(jié)尾的蛋白區(qū)段；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述外殼為標(biāo)簽蛋白；
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：將標(biāo)簽蛋白、靶蛋白和鐵蛋白的基因依次連接的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分離純化后即可獲得所述蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述靶蛋白的氨基酸序列如SEQ?IDNO:1所示，所述鐵蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述純化包括：蛋白標(biāo)簽純化和分子篩處理；
7.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)在靶蛋白的電鏡和晶體研究中的應(yīng)用，其特征在于，包括：
8.一種融
9.一種載體，其特征在于，包含用于表達(dá)權(quán)利要求8所述的融合蛋白的表達(dá)盒。
10.一種試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)納米雙殼、權(quán)利要求8所述的融合蛋白或者權(quán)利要求9所述的載體。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于電鏡和晶體研究的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)包括內(nèi)殼、外殼以及夾在內(nèi)外殼之間的靶蛋白，所述內(nèi)殼為鐵蛋白，所述鐵蛋白包括大腸桿菌來源的鐵蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述靶蛋白為α螺旋結(jié)尾的蛋白區(qū)段；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述外殼為標(biāo)簽蛋白；
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：將標(biāo)簽蛋白、靶蛋白和鐵蛋白的基因依次連接的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分離純化后即可獲得所述蛋白質(zhì)納米雙殼結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述靶蛋白的氨基酸...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：彭瑞資，張鑫娜，吳永祥，杜紫艷，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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