【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于藥物檢測領域，具體涉及一種松塔提取物中藥源性成分的檢測方法。
技術介紹
1、松塔是松科植物各種松樹的球果，呈棕褐色，多層鱗片，具有祛痰、止咳、平喘的功效，常用于治療慢性氣管炎、哮喘、咳嗽痰多等癥狀。近年來，隨著對松塔研究的深入，發現松塔提取物還具有抗hiv活性、抗拉沙病毒活性、抗腫瘤活性等多種藥理活性。但目前的研究多集中于對松塔所含化學成分的研究以及對活性成分的篩選，對于松塔的成分在體內的代謝過程、代謝產物的鑒定研究和進入體內后所發生的其他化學成分變化尚不明確。
2、入血成分檢測在藥物研發和臨床治療中扮演著至關重要的角色，它主要用于評估藥物的吸收、分布、代謝和排泄（adme）特性，以及藥物的療效和安全性。然而，盡管入血成分檢測非常重要，它也存在一些缺點和問題：（1）血液檢測只能提供藥物在血液中的濃度信息，而不能全面反映藥物在全身各組織中的分布情況；（2）藥物在體內的濃度是動態變化的，單一時間的血液樣本無法準確反映藥物的長期暴露情況；（3）不同個體對藥物的吸收、代謝和排泄能力存在差異，血液檢測無法完全解釋這些差異；（4）血液檢測無法準確反映藥物間的相互作用對藥物濃度的影響。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種松塔提取物中藥源性成分的檢測方法，所述方法能夠全面地反映松塔的提取物在體內的代謝和排泄情況。
2、本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的：
3、一種松塔提取物中藥源性成分的檢測方法，包括如下步
4、所述松塔提取物的制備方法如下：將松塔粗粉用85%乙醇提取，過濾，將殘渣用熱水提取，過濾除去熱水提取液。在室溫條件下，向殘渣中加堿液提取得到堿性提取液。用醋酸將堿性提取液的ph值調至5，濃縮、過濾，去除沉淀。濾液用1倍量乙醇沉淀，過濾，得沉淀d；濾液再用2倍量乙醇沉淀，過濾，得沉淀e；濾液再用5倍量乙醇沉淀24h，過濾，得沉淀f，沉淀d、e、f合并，即為松塔提取物。
5、優選的，給藥前后的血漿、糞便樣品均取自同一動物，以避免個體差異對檢測結果的影響。
6、優選的，松塔提取物檢測樣本制備方法，包括如下步驟：將松塔提取物與內標溶液ⅰ按質量體積比為1mg:10μl~1mg:20μl的比例渦旋，離心，取上清液用微孔濾膜過濾，用于uplc-ms/ms檢測。
7、更優選的，所述內標溶液ⅰ是將l-2-氯苯丙氨酸（l-2-chlorophenylalanine）溶于70%甲醇水溶液配制而成。
8、更優選的，內標溶液ⅰ在使用前需提前在-20℃預冷。
9、優選的，血漿樣品檢測樣本制備方法，包括如下步驟：取血漿樣品，冰上解凍，渦旋混勻，將血漿與內標溶液ⅱ按體積比為1:4~1:8的比例渦旋，離心。取上清液在-20℃靜置，再次離心，取上清液，用于uplc-ms/ms檢測。
10、更優選的，所述內標溶液ⅱ是將l-2-氯苯丙氨酸溶于乙腈-甲醇溶液（乙腈與甲醇體積比為1:4）配制而成。
11、優選的，糞便樣品檢測樣本制備方法，包括如下步驟：取糞便樣品，真空冷凍干燥，研磨至粉末狀；取樣品粉末，按質量體積比為1mg:20μl~1mg:30μl的比例加入內標溶液ⅰ，間歇式反復渦旋（優選的，每30min渦旋一次，每次持續30s，共渦旋6次），離心，取上清液用微孔濾膜過濾，用于uplc-ms/ms分析。
12、更優選的，內標溶液ⅰ在使用前需提前在-20℃預冷。
13、優選的，uplc-ms/ms檢測分析的色譜條件如下：
14、色譜柱為agilent?sb-c18?1.8μm，2.1mm×100mm；
15、流動相：a相為超純水-甲酸混合溶液（甲酸與超純水的體積比為0.1%），b相為乙腈-甲酸混合溶液（甲酸與乙腈的體積比為0.1%）；
16、洗脫梯度：0~9min，5%~95%b；9~10min，95%b；10~11min，95%~5%b；11~14min，5%b。
17、流速0.35ml/min；柱溫40℃；進樣量2μl。
18、電噴霧離子源（electrospray?ionization，esi）溫度500℃；離子噴霧電壓（is）5500v（正離子模式）/-4500v（負離子模式）；離子源氣體i（gsi）、氣體ii（gsii）和氣簾氣（cur）分別為50、60和25psi，碰撞誘導電離參數設置為高。qqq掃描使用mrm模式，并將碰撞氣體（氮氣）設置為中等。
19、與現有技術相比，本專利技術具有的有益效果：
20、1、本專利技術針對松塔中極性較大的一部分成分進行檢測，能夠系統地反映該部分成分在體內的代謝和排泄情況。同時收集給藥后的血漿和糞便樣品，可以更全面、準確地分析其吸收、代謝和排泄途徑。
21、2、采用本專利技術所述的技術方案，從給藥后的血漿樣品中發現了17種入血成分，其中原型成分15種，代謝產物2種；從給藥后的糞便樣品中發現了12種成分，其中原型成分10種，代謝產物2種。
22、3、常規的血漿、糞便樣本采集通常會通過不同的實驗動物進行采集，并且會另設一組不給藥的動物作為空白對照組。本專利技術通過對同一動物采集血漿、糞便樣品，并且將給藥前的血漿、糞便樣品作為空白對照，避免了因個體差異對檢測結果的影響，使檢測分析結果更準確，同時節省了藥品的用量，減少了實驗動物消耗。
23、4、與傳統的高效液相色譜和質譜聯用（hplc-ms）相比，本專利技術采用uplc-ms/ms技術進行檢測分析，顯著提高了定量分析的重復性和可靠性以及定性分析的準確性，較好地適應了現代藥物研究對自動化、高通量分析方法的需求。實驗中16min可完成對樣品的檢測，此法可對檢測樣品色譜信息進行全采集，且各色譜峰分離較好，為后期分析處理海量的代謝數據奠定基礎。
24、5、本專利技術以松塔提取物本身作為比對基礎，通過質譜裂解和保留時間進行比對，不依賴于標準品，適用性更強，即使松塔提取物中含有未知成分，也可與數據庫中的數據進行比對；克服了現有技術必須先通過查閱文獻，了解可能含有的物質，再進一步與標準品進行比對，當遇到沒有在該種屬植物中報道過的未知成分時，就無法進行檢測，在應用上受到極大限制的缺陷。
25、6、本專利技術加入l-2-氯苯丙氨酸作為內標，能夠確保儀器在檢測過程中的穩定性，保證檢測結果的準確。
26、7、本專利技術所述檢測方法對多種松樹的松塔均可適用，且具有操作簡便，實驗條件易于控制、快速準確，重現性好的優勢和特點。
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1.一種松塔提取物中藥源性成分的檢測方法，包括如下步驟：將松塔提取物口服給予健康動物，采集給藥前后的血漿、糞便樣品，通過UPLC-MS/MS檢測分析，在給藥后的血漿樣品中發現了17種入血成分，其中原型成分15種，代謝產物2種；在給藥后的糞便樣品中發現了12種成分，其中原型成分10種，代謝產物2種，其特征在于：所述松塔提取物的制備方法如下：將松塔粗粉用85%乙醇提取，過濾，將殘渣用熱水提取，過濾除去熱水提取液；在室溫條件下，向殘渣中加堿液提取得到堿性提取液；用醋酸將堿性提取液的pH值調至5，濃縮、過濾，去除沉淀；濾液用1倍量乙醇沉淀，過濾，得沉淀D；濾液再用2倍量乙醇沉淀，過濾，得沉淀E；濾液再用5倍量乙醇沉淀24h，過濾，得沉淀F，沉淀D、E、F合并，即為松塔提取物。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，給藥前后的血漿、糞便樣品均取自同一動物。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，松塔提取物檢測樣本制備方法包括如下步驟：將松塔提取物與內標溶液Ⅰ按質量體積比為1mg:10μL~1mg:20μL的比例渦旋，離心，取上清液用微孔濾膜過濾即得。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，糞便樣品檢測樣本制備方法包括如下步驟：取糞便樣品，真空冷凍干燥，研磨至粉末狀；取樣品粉末，按質量體積比為1mg:20μL~1mg:30μL的比例加入內標溶液Ⅰ，間歇式反復渦旋，離心，取上清液用微孔濾膜過濾即得。
5.根據權利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于，所述內標溶液Ⅰ是將L-2-氯苯丙氨酸溶于70%甲醇水溶液配制而成。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，血漿樣品檢測樣本制備方法包括如下步驟：取血漿樣品，冰上解凍，渦旋混勻，將血漿與內標溶液Ⅱ按體積比為1:4~1:8的比例渦旋，離心，取上清液在-20℃靜置，再次離心，取上清液即得。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述內標溶液Ⅱ是將L-2-氯苯丙氨酸溶于體積比為1:4的乙腈-甲醇溶液配制而成。
8.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，色譜檢測條件為：色譜柱為Agilent?SB-C18?1.8μm，2.1mm×100mm；流動相：A相為甲酸與超純水的體積比為0.1%的超純水-甲酸混合溶液，B相為甲酸與乙腈的體積比為0.1%的乙腈-甲酸混合溶液；洗脫梯度：0~9min，5%~95%B；9~10min，95%B；10~11min，95%~5%B；11~14min，5%B；流速0.35mL/min；柱溫40℃；進樣量2μL。
9.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，質譜檢測條件為：電噴霧離子源溫度500℃；離子噴霧電壓5500V/-4500V；離子源氣體I、氣體II和氣簾氣分別為50、60和25psi，碰撞誘導電離參數高；QQQ掃描使用MRM模式，碰撞氣體為中等。
...【技術特征摘要】
1.一種松塔提取物中藥源性成分的檢測方法，包括如下步驟：將松塔提取物口服給予健康動物，采集給藥前后的血漿、糞便樣品，通過uplc-ms/ms檢測分析，在給藥后的血漿樣品中發現了17種入血成分，其中原型成分15種，代謝產物2種；在給藥后的糞便樣品中發現了12種成分，其中原型成分10種，代謝產物2種，其特征在于：所述松塔提取物的制備方法如下：將松塔粗粉用85%乙醇提取，過濾，將殘渣用熱水提取，過濾除去熱水提取液；在室溫條件下，向殘渣中加堿液提取得到堿性提取液；用醋酸將堿性提取液的ph值調至5，濃縮、過濾，去除沉淀；濾液用1倍量乙醇沉淀，過濾，得沉淀d；濾液再用2倍量乙醇沉淀，過濾，得沉淀e；濾液再用5倍量乙醇沉淀24h，過濾，得沉淀f，沉淀d、e、f合并，即為松塔提取物。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，給藥前后的血漿、糞便樣品均取自同一動物。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，松塔提取物檢測樣本制備方法包括如下步驟：將松塔提取物與內標溶液ⅰ按質量體積比為1mg:10μl~1mg:20μl的比例渦旋，離心，取上清液用微孔濾膜過濾即得。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，糞便樣品檢測樣本制備方法包括如下步驟：取糞便樣品，真空冷凍干燥，研磨至粉末狀；取樣品粉末，按質量體積比為1mg:20μl~1mg:30μl的比例加入內標溶液ⅰ，間歇式反復渦旋，離心，取上清液...
【專利技術屬性】
技術研發人員：雷婷，江世智，王忠舉，劉繼，劉光明，李冬梅，劉熙，王飛飛，王祖定，
申請(專利權)人：大理大學，
類型：發明
國別省市：
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