【技術實現步驟摘要】
本專利技術書屬于白蛋白，具體涉及一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法。
技術介紹
1、細胞培養肉是通過在體外培養動物細胞并結合組織工程技術生產的肉類類似物，與傳統的畜牧業相比，具有減少資源消耗、降低溫室氣體排放等多種優勢。在細胞培養肉的制造過程中，細胞增殖依賴于合適的微載體。
2、現有技術中，微載體主要通過油包水乳液進行合成：通常是將水溶性的原料、疏水溶劑、交聯劑和乳化劑混合后在一定的轉速攪拌形成均一乳液，隨后通過一定的相分離操作得到微載體顆粒。該方法雖然能夠實現微載體的快速制備以及放大生產，但同時也帶來了在原料選擇以及乳化劑/交聯劑殘留等一系列缺陷，這些缺陷對微載體的使用效果以及后期細胞培養肉的食品安全產生了較大影響，不能廣泛應用于細胞培養和食品領域的。
技術實現思路
1、為了解決上述技術問題，專利技術人根據自己在白蛋白
積累的豐富經驗，研發出來一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法。
2、本專利技術的制備原理為：
3、一、修飾：
4、白蛋白的化學修飾是基于碳-碳雙鍵與巰基的click反應完成的，該反應具有操作簡便、條件溫和以及產率高的優點。碳-碳雙鍵與巰基的click反應屬于其中非常經典的反應范例，能夠在短時間內達到接近于100%的反應效率，因此常應用于化學修飾。白蛋白是含有三個同源的α-螺旋結構域的螺旋狀蛋白，三個結構域聚集在一起形成不對稱的心形結構，每個結構域中包含兩個亞級結構域，每個亞級結構域又由6個螺旋結構所組成的，見
5、而根據相關文獻報道，白蛋白的ⅰa亞級結構域中含有半胱氨酸殘基（cys），而ⅰa亞級結構域在整個白蛋白結構中暴露在外，因此該半胱氨酸殘基屬于易修飾位點。隨后，由于半胱氨酸殘基上存在巰基官能團，基于巰基和碳-碳雙鍵的點擊化學反應，將 n-乙基馬來酰亞胺連接到白蛋白分子上，得到修飾白蛋白，見圖1。
6、二、組裝
7、由于氮原子上乙基的存在，巰基與雙鍵加成后所形成的五元環結構具有較大的環張力，在親核試劑（例如水）的進攻下容易發生開環反應；再者，修飾白蛋白與純白蛋白組裝的基本原理是，由于修飾后的白蛋白中含有-nh2+-基團，因此在宏觀上修飾白蛋白呈現正電性；純白蛋白的等電點為pi=4.6，在中性（ph=7.4）環境下呈現負電性。因此，兩種物質之間存在較強的正負電吸引作用，能夠依靠靜電力發生組裝，宏觀上表現為團聚后出現顆粒狀物質，即得到的微載體。
8、在完成對白蛋白的修飾后，將修飾白蛋白溶解在弱酸性水溶液（ph=4.6）中。 n-乙基馬來酰亞胺與白蛋白上的巰基發生加成后所形成的五元環在水溶液中不穩定，容易水解而后得到羧基和酰胺基團。而酸性環境中酰胺基團中的仲胺結構非常易于質子化，形成帶正電荷的-nh2+-基團，見圖2。
9、此時準備純白蛋白的pbs水溶液（ph=7.4）并逐漸地加入上述修飾白蛋白的弱酸性水溶液中，通過靜電作用完成蛋白質組裝，見圖3。
10、三、純化
11、組裝完成后，使用低溫冷凍高速離心機離心獲得微載體顆粒，隨后棄去上清液，加入一定量去離子水漩渦震蕩洗滌三次，離心后通過冷凍干燥獲得最終產物。
12、因此，在微載體制備方法上進行創新成為了突破以上技術瓶頸的最優方法。蛋白質組裝體是一種或多種蛋白質通過共價連接、分子間作用力或氫鍵作用形成的蛋白質復合物，其制備簡單、無添加劑以及生物相容性好，主要應用于藥物遞送領域。而蛋白質作為一種天然生物高分子，被廣泛應用于微載體材料的制備。綜上所述，利用蛋白質組裝方法制備微載體在理論上成為了一種新型策略，該策略不但在原材料選擇上滿足細胞培養肉的制備要求，又避免了因乳化劑/交聯劑加入帶來的食品安全隱患。
13、為解決上述技術問題，本專利技術提供以下技術方案：一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，包括以下步驟：
14、s1：修飾，配置一定質量濃度的白蛋白水溶液和 n-乙基馬來酰亞胺的二甲基亞砜溶液，啟動磁力攪拌，將 n-乙基馬來酰亞胺的二甲基亞砜溶液逐漸滴加到白蛋白水溶液中，得到混合液；向混合液中加入一定量的三乙胺，常溫反應12小時后，向體系中加入100ml的去離子水，并使用截留分子量為3000kda的透析袋透析12小時，冷凍干燥后得到修飾白蛋白，存儲在-20℃的冰箱待用；
15、s2：組裝，配置一定量的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，ph值控制為4.6，將s1中制備的修飾白蛋白溶解在上述緩沖溶液中，得到修飾白蛋白溶液；啟動磁力攪拌，將純白蛋白pbs溶液滴加到修飾白蛋白溶液中，滴加過程測量整個體系的ph值，當ph值接近7.0時停止滴加；
16、s3：純化，使用低溫冷凍高速離心機對白蛋白組裝進行離心作業，溫度為4oc，得到組裝后的白蛋白顆粒，使用去離子水對微載體顆粒進行洗滌、離心操作，重復三次，得到成品，冷凍干燥后保存，等待表征。
17、進一步的，s1中，白蛋白水溶液的質量濃度為5?mg/ml，配置過程使用去離子水； n-乙基馬來酰亞胺二甲基亞砜溶液的質量濃度為5mg/ml，所用二甲基亞砜為無水二甲基亞砜；磁力攪拌轉速為800rpm；三乙胺用量為2-3ml；冷凍干燥過程中降溫速率為0.5℃/min至2℃/min，真空度為1-5pa，凍干時間為24小時。
18、進一步的，s2中，乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的配置方法是取乙酸鈉18g，加入乙酸9.8ml，最后加水稀釋至1l；修飾白蛋白溶液的質量濃度與純白蛋白pbs溶液的質量濃度比為1：1；磁力攪拌轉速為1000rpm/min。
19、進一步的，低溫冷凍高速離心機轉速為10000rpm，時間為30分鐘。
20、進一步的，步驟2中，當ph值接近7.0時，整個體系變渾濁，肉眼可觀。所用ph計為雷磁ph計（型號為phs-3g）
21、與現有技術相比較，本專利技術具有以下有益效果：
22、1、本專利技術選擇白蛋白為原材料，利用修飾白蛋白在一定理化條件下易于形成組裝體的方法制備微載體，在根本上避免了因原料、交聯劑以及乳化劑殘留所帶來的問題；
23、2、本專利技術基于白蛋白化學結構上的特點，對白蛋白進行人工修飾，利用修飾白蛋白定理化條件制備組裝體，該組裝體具備較好的結構穩定性，并且粒徑達到了微載體的使用要求。
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1.一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，其特征在于：S1中，白蛋白水溶液的質量濃度為5?mg/mL，配置過程使用去離子水；N-乙基馬來酰亞胺二甲基亞砜溶液的質量濃度為5mg/mL，所用二甲基亞砜為無水二甲基亞砜；磁力攪拌轉速為800rpm；三乙胺用量為2-3mL；冷凍干燥過程中降溫速率為0.5℃/min至2℃/min，真空度為1-5Pa，凍干時間為24小時。
3.根據權利要求1所述一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，其特征在于：S2中，乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的配置方法是取乙酸鈉18g，加入乙酸9.8mL，最后加水稀釋至1L；修飾白蛋白溶液的質量濃度與純白蛋白PBS溶液的質量濃度比為1：1；磁力攪拌轉速為1000rpm/min。
4.根據權利要求1所述一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，其特征在于：低溫冷凍高速離心機轉速為10000rpm，時間為30分鐘。
5.根據權利要求1所述一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，其特征在于：步驟2中，當pH
...【技術特征摘要】
1.一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種基于白蛋白可食用微載體的制備方法，其特征在于：s1中，白蛋白水溶液的質量濃度為5?mg/ml，配置過程使用去離子水；n-乙基馬來酰亞胺二甲基亞砜溶液的質量濃度為5mg/ml，所用二甲基亞砜為無水二甲基亞砜；磁力攪拌轉速為800rpm；三乙胺用量為2-3ml；冷凍干燥過程中降溫速率為0.5℃/min至2℃/min，真空度為1-5pa，凍干時間為24小時。
3.根據權利要求1所述一種基于白蛋白可...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王守偉，郭翔，祁宇，楊峰，唐鐸，趙鵬飛，李瑩瑩，李石磊，胡海娟，梁小娟，劉文婷，劉屹森，李暢，付周，郭晨，任文佳，李宇軒，時宏霞，
申請(專利權)人：中國肉類食品綜合研究中心，
類型：發明
國別省市：
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