【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】
本公開(kāi)涉及利用固相萃取技術(shù)從脂質(zhì)納米顆粒(lnp)包封的核酸制備樣品的方法。該方法利用具有陰離子交換功能的吸附劑將核酸與存在于此類(lèi)樣品中的各種脂質(zhì)組分分離，使得能夠?qū)怂?、脂質(zhì)組分或兩者進(jìn)行二級(jí)分析。
技術(shù)介紹
1、已發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)納米顆粒(lnp)包封的核酸可用作治療劑，例如用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)或用作新的疫苗平臺(tái)。例如，目前來(lái)自pfizer-biontech和moderna的covid-19信使rna(mrna)疫苗利用lnp來(lái)包封mrna使其免受破壞性酶的影響，并將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。在這些covid-19疫苗中使用的lnp含有1)可離子化脂質(zhì)，其正電荷與mrna的帶負(fù)電荷的磷酸骨架結(jié)合；2)幫助穩(wěn)定納米顆粒的聚乙二醇連接的(peg化的)脂質(zhì)；以及3)有助于納米顆粒結(jié)構(gòu)的磷脂和膽固醇分子。成千上萬(wàn)的這些脂質(zhì)組分包圍著mrna。此外，正在評(píng)價(jià)各種脂質(zhì)分子(天然存在的和合成的)的lnp結(jié)構(gòu)-功能和穩(wěn)定性特性。這些評(píng)價(jià)需要優(yōu)化化學(xué)計(jì)量。為了分析現(xiàn)有的基于lnp的核酸藥物產(chǎn)品和開(kāi)發(fā)研究?jī)烧?，需要用于定量存在于此?lèi)基于lnp的核酸產(chǎn)品中的脂質(zhì)組分和/或核酸的分析方法。
2、因此，本領(lǐng)域希望提供用于lnp包封的核酸的樣品制備技術(shù)以及分析方法，以促進(jìn)對(duì)存在的脂質(zhì)組分、存在的核酸或兩者的分離和定量。還希望提供對(duì)存在于此類(lèi)lnp包封的核酸中的核酸藥物物質(zhì)的穩(wěn)定，性/效力指示分析。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本技術(shù)總體上涉及用于從脂質(zhì)納米顆粒(lnp)包封的核酸制備樣品的方法。該方法通常特征在于使用溶解和
2、因此，在一個(gè)方面，本技術(shù)涉及從脂質(zhì)納米顆粒包封的核酸制備用于組成分析的樣品的方法，該方法包括：
3、將包含該脂質(zhì)顆粒包封的核酸的樣品溶解在有機(jī)溶劑中以提供包含溶解的脂質(zhì)和增溶的核酸的溶液；以及
4、在弱陰離子交換(wax)固相吸附劑上吸附所增溶的核酸。
5、在一些實(shí)施方案中，包含脂質(zhì)顆粒包封的核酸的樣品是配制的lnp包封的核酸藥物產(chǎn)品的樣品。
6、在一些實(shí)施方案中，wax固相吸附劑包含在其上布置有陰離子交換劑殘基的表面，該陰離子交換劑殘基具有在約5至約11范圍內(nèi)的pka。在一些實(shí)施方案中，陰離子交換劑殘基具有在約8至約10范圍內(nèi)的pka。
7、在一些實(shí)施方案中，陰離子交換劑殘基包括伯胺、仲胺、叔胺或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，陰離子交換劑殘基包括哌嗪。
8、在一些實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑包括c1-c4醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑是甲醇。在一些實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑是正丙醇。
9、在一些實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑還包括選自由以下組成的組的添加劑：酸、堿、洗滌劑、緩沖劑、鹽以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，添加劑包括可離子化陽(yáng)離子堿。在一些實(shí)施方案中，可離子化陽(yáng)離子堿包括銨或三烷基銨離子。
10、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括從wax固相吸附劑中除去所溶解的脂質(zhì)，從而形成基本上不含核酸的脂質(zhì)樣品。在一些實(shí)施方案中，除去所溶解的脂質(zhì)包括使所溶解的脂質(zhì)通過(guò)wax固相吸附劑。在一些實(shí)施方案中，除去所溶解的脂質(zhì)還包括使有機(jī)溶劑流過(guò)wax固相吸附劑并收集穿過(guò)其流過(guò)的有機(jī)溶劑以提供一種或多種洗出液；以及將該一種或多種洗出液與已被允許通過(guò)wax固相吸附劑的所溶解的脂質(zhì)合并。
11、在一些實(shí)施方案中，方法還包括通過(guò)與合適的檢測(cè)方法(諸如可調(diào)的雙波長(zhǎng)紫外光/可見(jiàn)光(tuv)檢測(cè)、蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜法、帶電荷的氣溶膠或折射率)聯(lián)用的高效液相色譜法分析脂質(zhì)樣品。
12、在一些實(shí)施方案中，方法還包括從wax固相吸附劑洗脫所吸附的核酸，從而形成基本上不含脂質(zhì)的核酸樣品。在一些實(shí)施方案中，洗脫包括使水性緩沖液流過(guò)wax固相吸附劑，其中該水性緩沖液具有ph，該ph大于或等于wax固相吸附劑的陰離子交換劑殘基的pka。
13、在一些實(shí)施方案中，水性緩沖液包含至多約50體積％的非水性溶劑。在一些實(shí)施方案中，非水性溶劑包括c1-c4醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或它們的組合。
14、在一些實(shí)施方案中，水性緩沖液具有約8至約12.5或約8.5至約12的ph。在一些實(shí)施方案中，水性緩沖液是ph為約11的碳酸氫銨溶液。
15、在一些實(shí)施方案中，洗脫還包括使有機(jī)溶劑流過(guò)wax固相吸附劑并收集穿過(guò)其流過(guò)的有機(jī)溶劑以提供一種或多種洗出液；以及將該一種或多種洗出液與已經(jīng)用水性緩沖液從wax固相吸附劑洗脫的核酸合并。
16、在一些實(shí)施方案中，方法還包括通過(guò)與合適的檢測(cè)方法(諸如可調(diào)的雙波長(zhǎng)紫外光/可見(jiàn)光(tuv)檢測(cè)、蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜法、帶電荷的氣溶膠或折射率)聯(lián)用的高效液相色譜法分析核酸樣品。
17、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括用核酸酶消化存在于核酸樣品中的核酸的至少一部分。
18、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括水解存在于核酸中的核酸的至少一部分以形成成分殘基的混合物。
19、在一些實(shí)施方案中，該方法包括消化吸附在吸附劑上的所增溶的核酸的至少一部分，從而形成核酸消化產(chǎn)物的吸附混合物，其中消化包括使吸附劑與核酸酶接觸；以及從wax固相吸附劑洗脫核酸消化產(chǎn)物的混合物，從而形成核酸消化樣品。
20、在一些實(shí)施方案中，洗脫包括使水性緩沖液流過(guò)wax固相吸附劑，其中該水性緩沖液具有ph，該ph大于或等于wax固相吸附劑的陰離子交換劑殘基的pka，并且其中所述水性緩沖液包含至多約50體積％的非水性溶劑。
21、在一些實(shí)施方案中，非水性溶劑包括c1-c4本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種制備用于組成分析的樣品的方法，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述WAX固相吸附劑包含在其上布置有陰離子交換劑殘基的表面，所述陰離子交換劑殘基具有在約5至約11范圍內(nèi)的pKa，所述陰離子交換劑殘基包括伯胺、仲胺、叔胺或它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述陰離子交換劑殘基包括哌嗪。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括C1-C4醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或它們的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括正丙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑還包括選自由以下組成的組的添加劑：酸、堿、洗滌劑、緩沖劑、鹽以及它們的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述添加劑包括可離子化陽(yáng)離子堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括從所述WAX固相吸附劑中除去所溶解的脂質(zhì)，從而形成基本上不含核酸的脂質(zhì)樣品，其中除去所溶解的脂質(zhì)包括使所溶解的脂質(zhì)通過(guò)所述WAX
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中除去所溶解的脂質(zhì)還包括：
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括從所述WAX固相吸附劑洗脫所吸附的核酸，從而形成基本上不含脂質(zhì)的核酸樣品。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中洗脫包括使水性緩沖液流過(guò)所述WAX固相吸附劑，其中所述水性緩沖液具有大于或等于所述WAX固相吸附劑的所述陰離子交換劑殘基的pKa的pH，所述水性緩沖液包含至多約50體積％的非水性溶劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述水性緩沖液具有約8至約12.5或約8.5至約12的pH。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括通過(guò)高效液相色譜法、質(zhì)譜法或它們的組合來(lái)分析所述脂質(zhì)樣品和所述核酸樣品中的一者或多者。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括用核酸酶消化存在于所述核酸樣品中的所述核酸的至少一部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括水解存在于所述核酸樣品中的所述核酸的至少一部分以形成成分殘基的混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括：
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中洗胞包括使水性緩沖液流過(guò)所述WAX固相吸附劑，其中所述水性緩沖液具有大于或等于所述WAX固相吸附劑的所述陰離子交換劑殘基的pKa的pH，并且其中所述水性緩沖液包含至多約50體積％的非水性溶劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非水性溶劑包括C1-C4醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或它們的組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述水性緩沖液具有約7至約12.5或約8至約12的pH。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括通過(guò)高效液相色譜法、質(zhì)譜法或它們的組合來(lái)分析所述核酸消化樣品。
...【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】
1.一種制備用于組成分析的樣品的方法，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述wax固相吸附劑包含在其上布置有陰離子交換劑殘基的表面，所述陰離子交換劑殘基具有在約5至約11范圍內(nèi)的pka，所述陰離子交換劑殘基包括伯胺、仲胺、叔胺或它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述陰離子交換劑殘基包括哌嗪。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括c1-c4醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或它們的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括正丙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑還包括選自由以下組成的組的添加劑：酸、堿、洗滌劑、緩沖劑、鹽以及它們的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述添加劑包括可離子化陽(yáng)離子堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括從所述wax固相吸附劑中除去所溶解的脂質(zhì)，從而形成基本上不含核酸的脂質(zhì)樣品，其中除去所溶解的脂質(zhì)包括使所溶解的脂質(zhì)通過(guò)所述wax固相吸附劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中除去所溶解的脂質(zhì)還包括：
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括從所述wax固相吸附劑洗脫所吸附的核酸，從而形成基本上不含脂質(zhì)的核酸樣品。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中洗脫包括使水性緩沖液流過(guò)所述wax固相吸附劑，其中所述水性緩沖液具有大于或等于所述wa...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：M·A·勞伯，B·奧爾登，M·M·蓋伊，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：沃特世科技公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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